過(guò)表達(dá)NADH激酶基因?qū)︶劸平湍敢掖及l(fā)酵的影響

王寒，張梁，石貴陽(yáng)

江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

20世紀(jì)80年代，由于石油的禁運(yùn)和缺乏，全球燃料危機(jī)在很多國(guó)家引起了極大的關(guān)注。而人們更為關(guān)心的是尋找一種可替代的燃料資源，乙醇首當(dāng)其沖被列入其中[1]。乙醇作為可再生資源有諸多優(yōu)勢(shì)，能減少溫室氣體的排放，減少有毒廢氣的釋放，提高全球能源效率，減少燃料成本等[2]。因此，清潔燃料乙醇的生產(chǎn)成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)。

甘油是乙醇生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，在厭氧條件下大約 4%的碳源會(huì)流向生成甘油的代謝支路。而這些碳源在不增加成本的情況下每年將會(huì)多產(chǎn)生1.25億L的乙醇[3]。因此，為了提高乙醇的產(chǎn)量，阻斷或者削弱甘油的代謝通路是非常必要的。甘油在釀酒酵母細(xì)胞中起著調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡的作用，厭氧條件下有機(jī)酸和生物量生成過(guò)程產(chǎn)生的NADH只能通過(guò)甘油形成途徑來(lái)氧化，甘油的合成是胞內(nèi)NAD+再生的主要途徑[4]。甘油的生成經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)，第一步反應(yīng)是甘油合成的限速步驟[5]，磷酸二羥基丙酮在由GPD1和GPD2編碼的3-磷酸甘油脫氫酶的作用下還原為 3-磷酸甘油，隨后在 GPP1和 GPP2基因編碼的 3-磷酸酯酶的作用下，脫去磷酸生成甘油[6]。

為維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，生物合成反應(yīng)中產(chǎn)生的過(guò)量的 NADH必須被氧化成NAD+，以維持一定的比例。釀酒酵母含有3種NADH激酶基因，分別是UTR1、YEF1和POS5。Pos5p定位于線粒體基質(zhì)，將 NADH轉(zhuǎn)化為NADPH，是線粒體 NADPH 的主要來(lái)源[7]。Strand等[8]通過(guò)對(duì) Pos5p氨基末端分析，其前17個(gè)氨基酸為線粒體定位信號(hào)肽。NADH激酶在維持線粒體DNA的穩(wěn)定性和氧化脅迫反應(yīng)方面有很重要的作用[9]。Bro等[10]根據(jù)釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測(cè)了NADH激酶的表達(dá)可以使釀酒酵母乙醇產(chǎn)量提高，甘油產(chǎn)量降低。Hou等[11]在細(xì)胞質(zhì)中超表達(dá)NADH激酶基因，明顯改變了代謝流向，使代謝流從 CO2轉(zhuǎn)向乙醇，提高了乙醇的產(chǎn)量，但同時(shí)卻積累了木糖醇。故而，如何降低甘油的產(chǎn)量，同時(shí)又能將胞內(nèi)過(guò)量的NADH氧化成NAD+，是對(duì)甘油途徑改造的有效方案之一。

本文旨在對(duì)釀酒酵母敲除 GPD2的同時(shí)加強(qiáng)POS5基因的表達(dá)，以期達(dá)到降低甘油產(chǎn)量從而提高乙醇產(chǎn)量的目的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)去除POS5基因前17個(gè)氨基酸，使其在細(xì)胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)，從而改善由于 GPD2敲除引起的胞內(nèi)氧化還原的失衡問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

工業(yè)酒精酵母單倍體菌株 S1 (MATa, 野生型，由工業(yè)酒精酵母CICIMY0086分離得到)，S2 (MATa, gpd2Δ::HyBR)由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[10]，E. coli JM109 (recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi (Lac-proAB)F'[traD36 proAB+lac1qlacZM15])，pMD18T-Simple (TaKaRa)，質(zhì)粒 pMGKR和 pSH47-HyBR為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[12]，其他菌株和質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

氨芐青霉素的工作濃度為100 μg/mL。

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉，用于工業(yè)酒精酵母的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃。潮霉素B的工作濃度為200 μg/mL，300 μg/mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖150 g，(NH4)2SO47.5 g，KH2PO43.5 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水定容到1 L。開(kāi)始發(fā)酵時(shí)加入過(guò)濾除菌后的消泡劑300 μL，吐溫–80 420 mg，麥角甾醇10 mg。

1.2 引物

實(shí)驗(yàn)用引物合成訂自上海生工生物工程有限公司。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)分子生物學(xué)操作

大腸桿菌感受態(tài)制備，質(zhì)粒的提取、酶切、純化，載體與DNA片段的連接，酵母基因組提取等方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。

1.3.2 敲除 GPD2的同時(shí)整合表達(dá) POS5質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank已知的序列，以工業(yè)酒精酵母染色體為模板，以G1F、G1R、G2F、G2R、POS5F、POS5R為引物，PCR分別擴(kuò)增出GPD2基因兩端的同源臂 450 bp、383 bp以及 POS5基因片段；以質(zhì)粒pMGKR為模板，以PGK1F和PGK1R為引物，擴(kuò)增得到PGK1P-PGK1T啟動(dòng)子和終止子；以質(zhì)粒 pSH47-HyBR為模板，以HyrF和HyrR為引物，擴(kuò)增得到HyBR抗性片段。利用重疊延伸PCR技術(shù)將GPD2兩段同源臂拼接，并與 pMD18T-Simple連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，驗(yàn)證得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒pMD-Δgpd2，經(jīng)Hind /ⅢSacⅠ雙酶切線性化，與經(jīng)同樣酶切的PGK1P-PGK1T片段連接得到質(zhì)粒 pMD-Δgpd2-PGK1用 KpnⅠ/SacⅠ酶切，繼而與經(jīng)相同酶切的 HyBR抗性片段連接得到質(zhì)粒 pDGPH。pDGPH質(zhì)粒經(jīng) BamHⅠ/SalⅠ酶切與徑同樣酶切的POS5片段連接，最終得到重組質(zhì)粒pDGPH-POS5。

表1 引物序列表Table 1 Primers sequence table

1.3.3 重組質(zhì)粒pDGPH-POS5的轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒pDGPH-POS5經(jīng)NotⅠ和Nhe Ⅰ雙酶切，得到4.5 kb左右含有GPD2上下游基因同源臂的敲除突變盒 gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[13-14]將突變盒轉(zhuǎn)入工業(yè)酒精酵母單倍體菌株S1 (MATa)，涂布pH 8.5，潮霉素B濃度為200 μg/mL的YEPD抗性平板培養(yǎng)2?3 d，挑選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種到潮霉素B濃度300 μg/mL的YEPD平板上，排除假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后，PCR驗(yàn)證。

1.3.4 NADH激酶酶活的測(cè)定方法

NADH激酶酶活測(cè)定方法按參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。酶活定義1 IU為30 ℃ 1.0 mL 反應(yīng)液1 min 內(nèi)產(chǎn)生 1.0 μmol NADPH 的量[15]。

粗酶液中的蛋白含量用Bradford方法[16]測(cè)定，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 胞內(nèi)NADH含量的測(cè)定方法

樣品處理：取發(fā)酵液30 mL放置于液氮中60 s以達(dá)到快速冷卻并阻斷細(xì)胞的進(jìn)一步代謝。為了提取NADH和NAD+，菌體真空冷凍干燥 24 h，在 50 mmol/L KOH、30%乙醇和22 mmol/L硼砂中解凍。提取的樣品用3 mol/L HCl調(diào) pH 至 9.0?9.4，放置在冰上 30 min。10 000 r/min離心 10 min，去除上清液，置于–70 ℃保存?zhèn)溆肹17]。

分析時(shí)取出菌體，加入 4 ℃預(yù)冷的細(xì)胞破碎液 (50 mmol/L PBS)，超聲波處理10 min，4 ℃離心，上清液經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾。

HPLC條件：色譜柱column stable-C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相A：100% 100 mmol/L PBS (pH 7.0)；流動(dòng)相B：50% 100 mmol/L PBS(pH 7.0)，50%甲醇。流速1 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，340 nm[18]。

其中，NAD+和NADP+在254 nm處有吸收峰，而NADH和NADPH在254 nm和340 nm處均有吸收峰，其中還原態(tài)輔酶 NADH和NADPH以340 nm處吸收峰積分。

1.3.6 乙醇發(fā)酵工藝

分別挑取原始菌株和重組菌株的單菌落接種到20 mL YEPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h；以10%接種量轉(zhuǎn)接到50 mL YEPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后OD達(dá)到10.0左右。以5%接種量將種子液接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制初始OD值在0.5左右。30 ℃恒溫靜置發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中每隔4 h取樣一次，測(cè)定相關(guān)的發(fā)酵性能參數(shù)。

1.3.7 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)

發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和丙酮酸含量用HPLC檢測(cè)。

HPLC條件：色譜柱Shodex SH1011，流動(dòng)相0.01 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min，柱溫50 ℃，示差折光檢測(cè)器Shodex RI10。

菌體得率：取30 mL樣品，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌的生理鹽水洗滌菌體 2?3次，再次收集菌體，棄上清后將菌體置于105 ℃下烘至恒重后稱重，計(jì)算菌體得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除GPD2的同時(shí)整合表達(dá)POS5質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒 pMD-Δgpd2、pMD-Δgpd2-PGK1、pDGPH、pDGPH-POS5的酶切驗(yàn)證如圖1所示。

2.2 重組菌 S3 (gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR)的驗(yàn)證

將含有 GPD2上下游基因同源臂的敲除突變盒 gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR (約 4.5 kb，如圖2所示)轉(zhuǎn)入原始菌S1中，在pH 8.5、潮霉素B濃度為200 μg/mL的YEPD抗性平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，提取相應(yīng)酵母染色體作為模板，以G1F和G2R為引物，如果PCR擴(kuò)增得不到GPD2基因，證明重組菌的GPD2基因已經(jīng)敲除，以原始菌作為陰性對(duì)照，原始菌可擴(kuò)增得到1 323 bp大小的GPD2基因；以 HyrF和 HyrR為引物，重組菌可擴(kuò)增得到1 335 bp大小的HyBR抗性片段，原始菌擴(kuò)增得不到HyBR片段；以PGK1F和POS5R、POS5F和PGK1R分別作為兩對(duì)引物，可擴(kuò)增得到片段PGK1P-POS5和POS5-PGK1T，證明POS5基因已經(jīng)整合到重組菌的染色體上。PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。

圖1 不同質(zhì)粒酶切的驗(yàn)證Fig. 1 Verification of the different plasimids digested by corresponding enzymes. M: 1 kb marker;2: pMD-Δgpd2 digested with NotⅠ and NheⅠ;3: pMD-Δgpd2 digested with Hind Ⅲ; 4: pDGPH digested with Hind Ⅲ, KpnⅠ and SacⅠ;5: pDGPH-POS5 digested with BamH Ⅰ and SalⅠ.

圖2 敲除突變盒的驗(yàn)證Fig. 2 Verification of the cassette of gene deletion. M:1 kb marker; 1: a cassette gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR.

圖3 重組菌S3 PCR驗(yàn)證Fig. 3 Verification of recombinant strain S3 PCR amplification. M: 1 kb marker; 1: the PCR product of GPD2 amplified from S3 with primers G1F and G2R; 2:negative control of GPD2 from S1; 3: the PCR product of HyBR amplified from S3 with primers HyrF and HyrR; 4: negative control of HyBR from S1; 5: the PCR product of PGK1P-POS5 amplified from S3 with primers PGK1F and POS5R; 6: the PCR product of POS5-PGK1T amplified from S3 with primers POS5F and PGK1R.

2.3 NADH激酶酶活的測(cè)定

按方法1.3.4所述對(duì)重組菌和原始菌株進(jìn)行NADH激酶酶活的測(cè)定。

由表2可知，重組菌S3胞內(nèi)的NADH激酶的酶活明顯高于原始菌S1和突變菌S2，證明了NADH激酶基因 POS5在重組菌中得到了過(guò)量表達(dá)。

2.4 重組菌胞內(nèi)NADH含量的測(cè)定

發(fā)酵12 h后取樣，測(cè)定重組菌S3、S2和原始菌S1胞內(nèi)的NADH濃度。

由表3可知，NADH激酶基因 POS5的超表達(dá)調(diào)節(jié)了重組菌S3胞內(nèi)的NADH濃度，略高于原始菌S1的胞內(nèi)NADH濃度，但卻大大低于重組菌S2的NADH濃度。重組菌S2由于敲除了甘油合成途徑的關(guān)鍵酶基因GPD2，使得甘油合成減少，導(dǎo)致胞內(nèi)NADH濃度大量提高，而重組菌在敲除 GPD2的同時(shí)過(guò)表達(dá)了 POS5基因，不僅降低甘油產(chǎn)量，同時(shí)緩解了胞內(nèi)NADH的高濃度。

表2 NADH激酶酶活比較Table 2 Enzyme assay of NADH kinase

表3 胞內(nèi)NADH濃度比較Table 3 Intracellular NADH concentration

2.5 重組菌發(fā)酵性能研究

在 15%葡萄糖濃度的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，比較重組菌S3和S2與原始菌株S1的發(fā)酵性能的差異。

發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)曲線如圖4A所示，重組菌 S3 (MATa, gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR)、S2 (MATa, gpd2Δ::HyBR)的生長(zhǎng)速率均低于原始菌S1 (MATa)，但S3的生長(zhǎng)速率要快于S2，說(shuō)明在GPD2基因缺失的情況下，NADH激酶的表達(dá)加快了菌體的生長(zhǎng)速率。甘油途徑的阻斷不僅影響了菌體的生長(zhǎng)速率，而且也影響了酵母的發(fā)酵性能。從圖4B、4C看出，S3和S2的耗糖能力和初始產(chǎn)乙醇能力明顯低于 S1。重組菌 S3和 S2的乙醇產(chǎn)量分別為 68.04 g/L和65.43 g/L，均高于原始菌 S1的 63.01 g/L，S3和S2的乙醇得率 (g ethanol/g glucose)分別提高了8%和3.86%。從圖4D看出，重組菌S3和S2的甘油產(chǎn)量分別為4.29 g/L和5.10 g/L，分別低于原始菌的 6.47 g/L，S3和 S2的甘油得率(g glycerol/g glucose)分別降低了33.64%和21.11%。

由表 4可以證明在釀酒酵母中敲除 GPD2同時(shí)表達(dá)過(guò)量 POS5基因提高乙醇產(chǎn)量的策略是可行的。NADH激酶基因 POS5的表達(dá)，以ATP為磷酸供體，催化NADH生成 NADPH，通過(guò)降低甘油的產(chǎn)量使得乙醇的產(chǎn)量提高，證明了輔酶基因的表達(dá)會(huì)在一定程度上影響酵母的代謝過(guò)程，與前期的報(bào)道相符[19]。重組菌S2的乙酸和丙酮酸含量明顯低于 S1，可能是由于釀酒酵母調(diào)整代謝途徑來(lái)應(yīng)對(duì)甘油產(chǎn)量降低的一種機(jī)制[4]。而重組菌S3的最大比生長(zhǎng)速率、菌體得率以及副產(chǎn)物含量與原始菌株差異不大，證明整合表達(dá)POS5達(dá)到了預(yù)期的效果。

圖4 重組菌S3、S2與原始菌S1的發(fā)酵性能比較Fig. 4 The performance of strains S3, S2 and S1 in ethanol fermentation. (A)OD600, optical density at 600 nm versus time. (B)the concentration of glucose versus time. (C)the concentration of ethanol versus time. (D)the concentration of glycerol versus time.

表4 重組菌S3、S2與S1在15%葡萄糖濃度的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上的乙醇發(fā)酵情況Table 4 The performance of strains S3, S2 and S1 in ethanol fermentation on 15% glucose

3 討論

甘油在釀酒酵母代謝過(guò)程中有著不可比擬的重要作用，甘油的合成不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，而且厭氧條件下還用于維持胞內(nèi)的氧化還原平衡[20]。甘油途徑的阻斷對(duì)乙醇的產(chǎn)量有一定程度的提高，然而單純地阻斷或者削弱甘油途徑，并不能達(dá)到理想的結(jié)果[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種整合型質(zhì)粒，在敲除 GPD2基因的基礎(chǔ)上整合表達(dá)了 POS5基因，從而達(dá)到GPD2敲除能削弱甘油的合成，同時(shí)POS5的過(guò)量表達(dá)能調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡的效果，最終使得重組菌在不影響菌株生理特性的前提下降低甘油產(chǎn)量，在一定程度上提高乙醇的產(chǎn)量。結(jié)果表明，敲除突變盒 gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR的轉(zhuǎn)入，使得工業(yè)酒精酵母在不影響最大比生長(zhǎng)速率的前提下，乙醇得率提高了8%，甘油得率降低了33.64%。同時(shí)也調(diào)節(jié)了胞內(nèi)的氧化還原平衡。

在釀酒酵母生成乙醇的代謝途徑中，甘油是最主要的副產(chǎn)物，甘油途徑包括甘油合成途徑和甘油分解途徑，而這兩個(gè)途徑的改變對(duì)乙醇的產(chǎn)量可能都會(huì)產(chǎn)生影響。因此，從甘油途徑對(duì)釀酒酵母進(jìn)行基因改造，一方面包括阻斷或削弱甘油合成途徑，另一方面包括加強(qiáng)甘油分解途徑 (二羥丙酮途徑)。甘油合成途徑的關(guān)鍵酶基因是GPD2，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)敲除了GPD2，達(dá)到了比較理想的效果。而甘油分解途徑中存在兩個(gè)關(guān)鍵酶，由 GCY1編碼的甘油脫氫酶和由 DAK1編碼的二羥丙酮激酶，這條途徑用于轉(zhuǎn)化甘油，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓[22]。Yu等[23-24]以甘油為碳源，在釀酒酵母中同時(shí)過(guò)表達(dá)GCY1和 DAK1基因，得到的重組菌乙醇產(chǎn)量是野生菌株的2.4倍，證明了通過(guò)加強(qiáng)甘油分解途徑來(lái)提高乙醇產(chǎn)量的策略是可行的。唐燕[25]以葡萄糖為碳源，在工業(yè)酒精酵母中，整合表達(dá)GCY1和 DAK1基因，重組菌比野生型酵母酒精得率提高了 2.9%，甘油產(chǎn)率降低了 24.9%。后期的實(shí)驗(yàn)可以將釀酒酵母的甘油合成和甘油分解途徑相結(jié)合，同時(shí)選取最佳的輔酶代謝途徑，即在敲除甘油合成關(guān)鍵酶基因 GPD2的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)表達(dá)甘油分解關(guān)鍵酶基因GCY1和DAK1，從而盡量減少甘油的生成量，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)輔酶基因 POS5，使胞內(nèi)的 NADH含量維持在合理的水平，最終使得乙醇的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。

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