短膠法預(yù)處理含高濃度去垢劑的蛋白樣品

馬首智，張濤，翟琳輝，孫玉琳，徐平，趙曉航,4

1 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

3 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

4 海軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100048

質(zhì)譜分析前蛋白樣品預(yù)處理是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前普遍認(rèn)為，含高濃度去垢劑的緩沖液有助于充分抽提蛋白，含有4% SDS、0.1 mol/L DTT去垢劑的緩沖液的使用越來越廣泛。但高濃度去垢劑會對下游的蛋白定量、酶解等步驟造成干擾，常用的蛋白定量方法，如BCA (Bcinchoninic acid)法和Bradford法 (又名考馬斯亮藍(lán)法、CBB法)都不適用。甚至可用于雙向電泳蛋白樣品預(yù)處理的 2-D quant 試劑盒[1]都無法耐受 4%的 SDS。因此，急需發(fā)展耐受高濃度去垢劑的蛋白樣品預(yù)處理方法。

對于含高濃度去垢劑的蛋白樣品，主要有兩種預(yù)處理方法，包括超濾輔助樣品制備 (Filter aided sample preparation methods, FASP)[2-6]和短膠法 (Short gel)[7]。與其他方法相比，短膠法在分析微量蛋白樣品時(shí)更有優(yōu)勢[8]。與常規(guī)SDS-PAGE分析不同，短膠法只進(jìn)行短距離 (2–25 mm)凝膠電泳，減弱樣品蛋白的稀釋程度。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，短膠法同樣可以用于蛋白定量[9]。但短膠法定量的線性范圍還不清楚。本研究分析了短膠法定量的線性范圍，并將短膠法用于質(zhì)譜前蛋白樣品預(yù)處理。結(jié)果表明，短膠法在1–8 μg BSA范圍內(nèi)有極高線性度，且定量重復(fù)性較好，與下游技術(shù)兼容，定量后的蛋白可直接進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，是一種值得推廣的蛋白樣品預(yù)處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

敲降靶蛋白的食管癌 KYSE140細(xì)胞由本室構(gòu)建，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清和1%青鏈霉素，于37 ℃、含5%二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)。蛋白提取緩沖液為100 mmol/L Tris，pH 7.5；4% SDS；100 mmol/L DTT和蛋白酶抑制劑等。轉(zhuǎn)膜液為25 mmol/L Tris；195 mmol/L甘氨酸和20%甲醇。蛋白抽提液為5%甲酸和50%乙腈。雞尾酒式蛋白酶抑制劑購自美國 Roche公司。胰蛋白酶購自美國 Promega公司。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA)標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠抗人β-actin抗體購自美國Sigma公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自中杉金橋生物技術(shù)公司。ECL發(fā)光試劑盒購自普利萊公司。UPLC液相色譜系統(tǒng)為美國 Agilent公司產(chǎn)品，LTQ-Obitrap Velos質(zhì)譜系統(tǒng)為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。LAS 4000圖像采集儀為日本富士公司產(chǎn)品。

1.2 蛋白提取

對照細(xì)胞和siRNA處理的細(xì)胞培養(yǎng)至90%匯合度，將細(xì)胞置于冰上，加預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗兩遍。加入蛋白提取緩沖液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，冰上孵育30 min。超聲破碎后12 000 r/min、4 ℃離心15 min。上清分裝后儲存于–80 ℃冰箱備用。

1.3 短膠法蛋白定量

配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白并準(zhǔn)備適當(dāng)體積的待測樣品蛋白。加入 SDS-PAGE上樣緩沖液后，80 ℃加熱10 min。室溫高速離心5 min，保留上清。制備濃縮膠和分離膠，上樣后恒壓80 V電泳至溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠2 mm即停止電泳。加入考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行凝膠染色，脫色至凝膠背景清晰。使用圖像采集儀掃描凝膠圖相，并用Scion image軟件分析圖像灰度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的灰度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品蛋白的灰度值計(jì)算待測蛋白含量。

1.4 常規(guī)SDS-PAGE凝膠法蛋白定量

制備濃縮膠和分離膠，蛋白樣品上樣后80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)前沿出分離膠后停止。考馬斯亮藍(lán)G250凝膠染色，脫色至凝膠背景清晰。使用圖像采集儀掃描凝膠圖相，并采用Scion image軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 蛋白印跡定量

采用長膠法分離蛋白，電泳后的凝膠浸泡在轉(zhuǎn)膜液中平衡。安裝濾紙、PVDF膜、凝膠等轉(zhuǎn)膜三明治，用玻璃棒去除氣泡。4 ℃冷室中110 V恒壓電轉(zhuǎn)1 h。含有蛋白信息的PVDF膜浸泡于10%牛奶中室溫封閉1 h后，加入1∶5 000稀釋的β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后加1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。洗膜后加入ECL發(fā)光液，LAS4000圖像采集儀中采集圖像。

1.6 膠內(nèi)酶解

短膠電泳后對凝膠染色，切取蛋白條帶。將蛋白條帶切為小塊，加入脫色液脫色至無色后加入乙腈脫水并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。加入酶解緩沖液，37 ℃避光孵育12 h。蛋白消化結(jié)束后加入蛋白抽提液抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后的多肽儲存于–80 ℃冰箱備用。

1.7 LC-MS/MS

首先配制流動相，流動相A為2%乙腈溶于98%超純水，另外添加0.1%甲酸；流動相B為2%超純水溶于98%乙腈，另外添加0.1%甲酸。酶解后的多肽溶于100%的流動相A，自動上樣，梯度洗脫。液相梯度設(shè)定為在30 min內(nèi)逐漸由100%的流動相 A過渡到100%的流動相B。質(zhì)譜條件設(shè)定為：掃描質(zhì)荷比400–1 800的離子，噴霧電壓設(shè)定為2 000 V，選取一級質(zhì)譜中最高的10個離子進(jìn)行HCD碎裂并進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，一級質(zhì)譜分辨率為 30 000，二級質(zhì)譜分辨率為7 500，動態(tài)排除時(shí)間為45 s。動態(tài)排除窗口為正負(fù) 0.005 Da。每個多肽峰進(jìn)行一次二級質(zhì)譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 短膠法分析標(biāo)準(zhǔn)樣品蛋白

BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白短膠電泳結(jié)果表明，隨著蛋白含量升高，標(biāo)準(zhǔn)蛋白染色深度也逐漸加深。線性回歸分析表明在0.5–16 μg BSA范圍內(nèi)R2達(dá)到 0.983，與我們的前期結(jié)果一致[9]。其中，絕對線性范圍大約為 1–8 μg BSA，R2達(dá)到0.999，高于或低于這一范圍線性度都會降低(圖 1)。

2.2 短膠法測定樣本蛋白含量

用短膠法基于建立的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定兩種待測樣品，即siRNA處理細(xì)胞和對照RNA處理細(xì)胞的蛋白含量，計(jì)算 3個樣品蛋白的上樣量均為1.47 μg，在短膠法定量的線性范圍內(nèi)，可使用短膠法進(jìn)行定量 (圖 2)。重復(fù)上樣的蛋白樣品含量無差異，說明短膠法的重復(fù)性較好。

使用蛋白印跡法對短膠法測定的蛋白濃度進(jìn)行分析，結(jié)果表明，免疫印跡與短膠法測定的結(jié)果不一致。蛋白印跡方法測定的蛋白樣品中，兩個siRNA處理后的管家蛋白含量偏高 (圖2)。

圖1 BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白短膠電泳分析Fig. 1 Short gel analysis of BSA protein. (A)Shot gel electrophoresis of BSA. From 1 to 11 wells, the amount of BSA was 12, 8, 6, 4, 3, 2, 1.5, 1, 0.75 and 0.5 μg per well respectively. (B)Relationship between BSA amount(0.5–16 μg)and band intensity. (C)Relationship between BSA amount (1–8 μg)and band intensity.

2.3 常規(guī)SDS-PAGE分析樣本蛋白

為了分析導(dǎo)致兩種定量方法差異的原因，采用常規(guī) SDS-PAGE凝膠電泳分析了對照蛋白和siRNA處理后蛋白表達(dá)模式 (圖3)。結(jié)果顯示，對照蛋白與siRNA處理蛋白表達(dá)模式明顯不同。對照蛋白在50 kDa左右有明顯染色加深的條帶，這兩個蛋白的表達(dá)水平接近β-actin等內(nèi)參蛋白，而這兩個條帶在siRNA處理的蛋白中消失了。

2.4 LC-MS/MS分析樣本蛋白

短膠定量后的蛋白采用膠內(nèi)酶解法消化并進(jìn)行質(zhì)譜分析 (圖 4)。結(jié)果顯示，樣本質(zhì)譜信號在 1E8左右，質(zhì)譜信號較好。三個樣本的峰形不同，對照樣本最高峰的信號低于siRNA處理樣本，但對照細(xì)胞中高強(qiáng)度峰的數(shù)量多于siRNA處理細(xì)胞。說明對照樣品高豐度蛋白數(shù)量較多，但每個蛋白的含量較少，與常規(guī)SDS-PAGE法分析結(jié)果一致。

圖3 蛋白樣品常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig. 3 Samples analyzed by regular SDS-PAGE. Line 2 was loaded control protein, line 3 and 4 were loaded siRNA treated proteins as the same amounts. Line 1 was protein molecular weight marker. The band intensities were included controls (5)and siRNA treated proteins (6 and 7, two repeats). NL: normalized protein levels.

圖4 樣品蛋白的LC-MS/MS法分析Fig. 4 LC-MS/MS analysis of peptides of samples.Peptides derived from control protein (1), siRNA treated proteins (2 and 3, two repeats); NL: normalized protein levels.

3 討論

蛋白質(zhì)預(yù)處理是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。使用較高濃度的去垢劑和還原劑可以更有效地提取蛋白[10]。如本研究中使用的蛋白提取緩沖液含有4%的SDS和100 mmol/L的DTT，目前被國內(nèi)外主流蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室廣泛使用[11-15]。標(biāo)準(zhǔn)的FASP法對含這種緩沖液的樣品酶解后進(jìn)行多肽水平定量。但由于現(xiàn)有的蛋白定量方法對高濃度去垢劑的兼容性問題，目前還沒有很好的方法進(jìn)行蛋白水平的定量。

我們的結(jié)果表明，使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，短膠法定量的理論線性度可以達(dá)到0.999，當(dāng)樣品蛋白在這個濃度范圍內(nèi)時(shí)，即可使用短膠法進(jìn)行蛋白含量測定。但這種高線性度只存在于1–8 μg 標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA的條件下，當(dāng)BSA的含量高于或低于這個范圍時(shí)，短膠法定量的線性度會發(fā)生偏差。BSA是被各種定量方法廣泛使用的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，但蛋白質(zhì)組分析的樣品復(fù)雜度很高，部分蛋白性質(zhì)可能與BSA有差異，可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。所有的定量方法都有其線性區(qū)間。如 Bradford法按照使用的試劑不同，線性區(qū)間分別在 10?100 μg 或 1?10 μg 之間[16]。短膠法定量蛋白的線性區(qū)間在1?8 μg間，需要的蛋白量較少，與通常條件下蛋白提取量一致，而且避免了去垢劑、還原劑等雜質(zhì)的干擾，更適用于蛋白定量分析。

最近，曹嵩等對進(jìn)入濃縮膠中的蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)凝膠染色后使用近紅外成像進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)在 1?10 μg范圍內(nèi)線性度最高可達(dá)0.993[17]。與這種方法相比，短膠法在線性范圍大致相當(dāng)?shù)那闆r下，線性度更高，不需要大型儀器。而且定量的蛋白可以直接進(jìn)行后續(xù)膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析，節(jié)省樣品。

蛋白印跡也是常用的蛋白相對定量方法之一。這種方法首先采用SDS-PAGE分離蛋白，分離后的蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，并與帶標(biāo)記的抗體共孵育，采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白含量[18]。由于這種方法在第一步也采用SDS-PAGE，所以也不容易受到樣品中去垢劑等雜質(zhì)的影響。但蛋白印跡的方法通常需要選用一兩個內(nèi)參蛋白作為上樣量的對照。在內(nèi)參蛋白的選擇中可能帶來人為因素的影響。在一些條件下，內(nèi)參蛋白的含量會發(fā)生變化，與總蛋白的含量變化并不一致。例如，在本研究中，siRNA處理的細(xì)胞中有兩個高豐度蛋白表達(dá)下降。由于這兩個高豐度蛋白的含量減少，間接提高了β-actin在對照細(xì)胞蛋白中所占的比例。從而使總蛋白含量相同的情況下，β-actin的含量升高。這種情況下，使用蛋白印跡法測定高豐度蛋白含量并作為內(nèi)參會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。使用短膠定量可能是一個更好的選擇，因?yàn)槎棠z定量時(shí)所有蛋白都混合在一起進(jìn)行染色和分析，單個蛋白表達(dá)量的變化并不會影響總蛋白定量的準(zhǔn)確性。

在基于凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，雙向電泳[19]與常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳常用于蛋白質(zhì)分析步驟中。而蛋白分子在長距離電泳時(shí)，蛋白分子遷移率與實(shí)際的分子量并非完全一致[20]。長距離電泳時(shí)，不同的蛋白彼此分開，靈敏度下降，而且不同蛋白對考馬斯亮藍(lán)染料的響應(yīng)也不同[21]。為了達(dá)到好的顯色效果，需要的蛋白量也大大增加，也更容易引入人為干擾，不適合作為蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的方法。

短膠法處理的蛋白可以有效地進(jìn)行酶解并進(jìn)行質(zhì)譜分析[22-24]。常用的酶解方法是膠內(nèi)酶解[25]，膠內(nèi)酶解后再抽提多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。本研究中短膠濃縮的蛋白經(jīng)過胰蛋白酶酶解后，使用LC-MS/MS進(jìn)行半定量分析，質(zhì)譜結(jié)果顯示，質(zhì)譜峰的信號較好，達(dá)到 1E8水平，提示樣本蛋白得到了充分的消化和抽提。提示短膠法分析的蛋白可以方便地用于下游蛋白質(zhì)組學(xué)研究。siRNA處理的蛋白單個峰的信號強(qiáng)度更高，但峰的數(shù)量更少。說明由于對照細(xì)胞中存在高豐度蛋白，對其他蛋白產(chǎn)生稀釋作用，短膠法測定的蛋白含量更接近真實(shí)情況。

本研究分析了短膠定量的線性范圍，并使用短膠法進(jìn)行蛋白定量和質(zhì)譜前樣品預(yù)處理。結(jié)果表明短膠法是一種準(zhǔn)確、可靠的蛋白質(zhì)預(yù)處理方法，可以與高濃度去垢劑緩沖液相兼容，也不容易受蛋白表達(dá)差異的影響。短膠法可以同時(shí)完成蛋白定量、膠內(nèi)酶解及后續(xù)的質(zhì)譜鑒定等步驟，可以方便地用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，值得推廣。

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