四個(gè)脂肪酸合成酶基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的超表達(dá)提高長鏈多不飽和脂肪酸生物合成效率

朱貴明，Abdulmomen Ali Mohammed Saleh，Said Ahmed Bahwal，汪坤福，王明富，王迪迪，葛堂棟，孫潔

佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007

多不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)對人體具有獨(dú)特的作用和意義，是一類被廣泛研究和備受關(guān)注的脂肪酸。PUFAs包括ω-3和ω-6 PUFAs兩種類型，每一種類型又包括多個(gè)碳鏈長度不同、不飽和鍵數(shù)量不等的成員。20C、22C的多不飽和脂肪酸通常可稱為長鏈多不飽和脂肪酸 (Long-chain polyunsaturated fatty acids, LCPUFAs)。DHA(22:6n-3)、EPA (20:5n-3)和 ARA (即花生四烯酸，20:4n-6)是生物體內(nèi)活性最強(qiáng)的 3種多不飽和脂肪酸[1]，已經(jīng)被證實(shí)在促進(jìn)大腦發(fā)育和功能維持以及在預(yù)防和治療心血管疾病、炎癥、癌癥等多種疾病方面有著重要作用[2-5]。DHA和ARA已經(jīng)被作為重要的營養(yǎng)補(bǔ)充劑廣泛地添加到嬰幼兒奶粉等食物中；EPA又常稱為血管清道夫，通常和DHA一起食用，對心血管患者十分有益。

現(xiàn)有的研究結(jié)果比較明確地證實(shí)了在哺乳動(dòng)物體內(nèi) DHA 的生物合成是從 α-亞麻酸(18:3n-3)開始的。首先是 Δ6-脂肪酸去飽和酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)?8:4n-3，Δ6-脂肪酸延長酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)?20:4n-3，然后 Δ5-脂肪酸去飽和酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)?EPA (20:5n-3)，并在 Δ5-脂肪酸延長酶作用下進(jìn)一步延長為DPA (22:5n-3)。接下來DPA轉(zhuǎn)變成為DHA需要經(jīng)歷一個(gè)比較復(fù)雜而低效的過程，即所謂的“Sprecher pathway”：DPA被進(jìn)一步延長為 24:5n-3，然后被 Δ6-脂肪酸去飽和酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)?24:6n-3，然后經(jīng) β-氧化后生成DHA(22:6n-3)[6-7]。ω-6系多不飽和脂肪酸如ARA的合成過程與此類似，使用相同的酶系?？梢?，在多不飽和脂肪酸的合成過程中，Δ6/Δ5-脂肪酸去飽和酶和 Δ6/Δ5-脂肪酸延長酶這 4種酶尤為重要。然而，研究表明哺乳動(dòng)物中這些酶的效率是比較低的，例如 α-亞麻酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈HA的效率小于1%，亞油酸 (LA，18:2n-6)轉(zhuǎn)變?yōu)锳RA僅為0.2%[8-10]。因此，人體對更多的PUFAs需求主要依靠從食物來源獲取。在哺乳動(dòng)物中為什么絕大部分的ALA或LA不能被轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的長鏈多不飽和脂肪酸呢？很多學(xué)者對此進(jìn)行了各種研究，但得出的結(jié)論并不完全令人信服甚至不同研究結(jié)論互相矛盾。我們設(shè)想，如果通過轉(zhuǎn)基因方法提高多不飽和脂肪酸合成過程中關(guān)鍵性的幾種酶活性，繼而考察長鏈多不飽和脂肪酸的合成情況，可能會(huì)更好地解釋這一疑問。

本研究將來源人的 Δ6-脂肪酸去飽和酶基因fads2和Δ5-脂肪酸去飽和酶基因fads1以及來源于小鼠的 Δ6-脂肪酸延長酶基因 elovl5和Δ5-脂肪酸延長酶基因elovl2這4個(gè)多不飽和脂肪酸合成過程重要的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293T)中進(jìn)行超表達(dá)，使其相應(yīng)的酶活性增加，并在細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加LA和ALA兩種脂肪酸底物，經(jīng)過一定作用時(shí)間后收集細(xì)胞并提取脂肪酸，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析脂肪酸的組成和變化情況，從而探討哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的合成的一些深層次問題。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pcDNA3.1(-)為本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293T細(xì)胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、總RNA提取試劑RNAiso plus、RT-PCR試劑盒等購于寶生物工程 (大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購于天根生化科技 (北京)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為Hyclone產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建

來源于人的 Δ6-脂肪酸去飽和酶基因(fads2，編碼 445個(gè)氨基酸)和 Δ5-脂肪酸去飽和酶基因 (fads1，編碼448個(gè)氨基酸)以及來源于小鼠的 Δ6-脂肪酸延長酶基因 (elovl5，編碼300個(gè)氨基酸)和 Δ5-脂肪酸延長酶基因(elovl2，編碼297個(gè)氨基酸)這4個(gè)基因的多基因表達(dá)載體 pcDNA3.1-F2F1-E5E2以串聯(lián)獨(dú)立表達(dá)的方式構(gòu)建在pcDNA3.1質(zhì)粒上，每個(gè)目的基因各自有獨(dú)立的啟動(dòng)子和終止信號polyA，故能獨(dú)立表達(dá)不相互影響。此多基因表達(dá)載體總大小為12 760 bp。具體的載體構(gòu)建方法已經(jīng)另文發(fā)表[11]，本文不再詳述。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞生長培養(yǎng)基為高糖DMEM中添加 1%雙抗 (青霉素 10 000 U/mL＋鏈霉素10 000 μg/mL)、1%丙酮酸納 (11.0 mg/mL)、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清。轉(zhuǎn)染前1天將培養(yǎng)的細(xì)胞分散至 60 mm平皿，加無雙抗培養(yǎng)基5 mL培養(yǎng)，同時(shí)添加亞油酸 (LA)和α亞麻酸(ALA)。待其生長至90%左右匯合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000說明書要求進(jìn)行，轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒pcDNA3.1-F2F1-E5E2以及對照轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP各約為8 μg。轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集備用。

1.2.3 RT-PCR鑒定目的基因的超表達(dá)

取上述收集的細(xì)胞1/3用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)?？俁NA提取和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均按照寶生物工程(大連)有限公司相關(guān)試劑說明書進(jìn)行。簡言之，總 RNA提取之后先進(jìn)行定量測定各樣品含量，然后將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，每個(gè)樣品取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR檢測，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR中使用的目的基因表達(dá)檢測引物列表如下 (其中引物 ActD-s和 ActD-a用于檢測內(nèi)參基因β-actin)。

?

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL左右進(jìn)行電泳檢測，以觀察基因表達(dá)情況。

1.2.4 脂肪酸的提取與GC-MS分析

取上述收集的細(xì)胞余下的2/3用于脂肪酸提?。河萌ルx子水漂洗3次，1 000 r/m離心5 min，加入 1 mL 2.5% H2SO4/甲醇溶液，輕輕混勻，80 ℃水浴90 min，待冷卻至室溫，加入1.5 mL 0.9% NaCl溶液和1 mL正己烷，劇烈振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min，將脂肪酸萃取到有機(jī)相中，吸取上清經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后-80 ℃保存?zhèn)溆谩C-MS檢測時(shí)可添加適量的正己烷稀釋，使用儀器為安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀HP-5890/HP-5971。檢測使用參數(shù)參考Kang等文獻(xiàn)報(bào)道[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

脂肪酸含量等結(jié)果采用x±s (算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。組間數(shù)據(jù)比較采用Student’s t-test，以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。每一種脂肪酸百分含量按其峰面積除以表1中所列所有脂肪酸峰面積總和而計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)外源目的基因的轉(zhuǎn)染均實(shí)現(xiàn)了超表達(dá)

將多基因表達(dá)載體pcDNA3.1-F2F1-E5E2用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)利用pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒作為對照，其綠色熒光可以比較準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后第2天觀察細(xì)胞，可以看到對照組的綠色熒光，在轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光基本達(dá)到最強(qiáng)的狀態(tài)，約90%以上細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染，表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是成功的。在轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-F2F1-E5E2質(zhì)粒的細(xì)胞中各個(gè)目的基因均成功地被超表達(dá) (圖1)。

2.2 外源目的基因的超表達(dá)提高了 LA和ALA向長鏈PUFAs轉(zhuǎn)化的能力

通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)4個(gè)目的基因均獲得超表達(dá)后，我們提取細(xì)胞中的脂肪酸，并利用GC-MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。色譜圖中橫坐標(biāo)為各種脂肪酸出現(xiàn)的保留時(shí)間，不同的脂肪酸出現(xiàn)的時(shí)間不一樣，由此可以將各種脂肪酸在色譜圖中分別開來，再通過質(zhì)譜分析和搜庫對比就可以準(zhǔn)確判定各個(gè)色譜峰所代表的不同脂肪酸的具體種類。各個(gè)色譜峰的高低則表明此脂肪酸的含量，按照其峰面積計(jì)算出其含量，進(jìn)而可計(jì)算出每一種脂肪酸的百分含量 (表1)。這些數(shù)據(jù)表明，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-F2F1-E5E2質(zhì)粒的細(xì)胞中，fads2、fads1、elovl5和elovl2這4個(gè)目的基因的超表達(dá)顯著地促使LA和ALA轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的長鏈多不飽和脂肪酸，即LA被主要轉(zhuǎn)化為ARA (20:4n-6)以及少量的21:4n-6，ALA被轉(zhuǎn)化為EPA (20:5n-3)、DPA (22:5n-3)和DHA (22:6n-3)。其中，ω-3系多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng)，EPA、DPA和DHA差不多均提高了2倍以上，而且DHA的水平在ω-3系多不飽和脂肪酸達(dá)到了最高。顯然，在此實(shí)驗(yàn)條件下，ω-3系多不飽和脂肪酸的生物合成效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ω-6系多不飽和脂肪酸生物合成效率。此外，本研究結(jié)果還表明，4個(gè)目的基因的超表達(dá)并沒有改變ω-6與ω-3多不飽和脂肪酸之間的比例關(guān)系。

圖1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中目的基因fads2、fads1、elovl5和elovl2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig. 1 fads2, fads1, elovl5 and elovl2 transcripts in transfected cells were analyzed by RT-PCR. M: DNA markers;1: cells transfected with pcDNA3.1-EGFP; 2: cells transfected with pcDNA3.1-F2F1-E5E2.

圖2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP或pcDNA3.1-F2F1-E5E2質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的色譜圖 (局部)Fig. 2 Partial gas chromatograph traces showing fatty acid profiles of total cellular lipids extracted from the control cells transfected with pcDNA3.1-EGFP (A)and the cells transfected with pcDNA3.1-F2F1-E5E2 (B).

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP或pcDNA3.1-F2F1-E5E2質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的組成及含量變化Table 1 PUFA composition of total cellular lipids from the HEK293T cells transfected with pcDNA3.1-EGFP or pcDNA3.1-F2F1-E5E2

3 討論

在PUFAs合成過程中一類重要的酶為脂肪酸去飽和酶，它們以其自身的酶特異性在碳鏈上的特定位置引入雙鍵從而產(chǎn)生去飽和作用；另一類重要的酶類為脂肪酸延長酶，它們通過其碳鏈延長酶活性使較短的脂肪酸變?yōu)楦L的脂肪酸[13]。這兩類酶共同作用，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可將LA和ALA轉(zhuǎn)變成為更長鏈的多不飽和脂肪酸。

目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的脂肪酸去飽和酶大約有4種：Δ9、Δ6、Δ5和Δ8脂肪酸去飽和酶。Δ9脂肪酸去飽和酶可分別催化 16:0和18:0轉(zhuǎn)化為 16:1n-7和 18:1n-9，該酶廣泛地存在于所有哺乳動(dòng)物，但不參與哺乳動(dòng)物 PUFAs的生物合成；Δ6脂肪酸去飽和酶則以 18:2n-6和18:3n-3以及少量的16:1n-7和18:1n-9為反應(yīng)底物，是參與動(dòng)物PUFAs生物合成的第1個(gè)限速酶；Δ5脂肪酸去飽和酶的反應(yīng)底物為20:3n-6和20:4n-3以及少量的18:2n-7和20:2n-9，該酶對 ω-3系列的脂肪酸具有更強(qiáng)的酶活性，且反應(yīng)速度高于 Δ6脂肪酸去飽和酶；Δ8脂肪酸去飽和酶是在大鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)的，可催化20:2n-6轉(zhuǎn)化為20:3n-6[14-16]。

哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸碳鏈延長酶有 7種，命名為 ELOVL 1-7。其中，ELOVL-1、ELOVL-3和 ELOVL-6脂肪酸延長飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，ELOVL-2、ELOVL-4和ELOVL-5則延長多不飽和脂肪酸。ELOVL-5同時(shí)還可以延長一些單不飽和脂肪酸，但主要是延 長 γ-linolenoyl-CoA (18:3n-6 CoA)， 而ELOVL-2主要延長 22C 的 PUFAs[17-20]。ELOVL-4除了延長28C和30C的超長鏈飽和脂肪酸，還延長 28C–38C超長鏈多不飽和脂肪酸(它們獨(dú)特地在視網(wǎng)膜、睪丸和大腦中表達(dá))[21-26]。ELOVL-7的作用底物尚不清楚，體外實(shí)驗(yàn)表明它主要延長20C超長鏈飽和脂肪酸[27]。

由此可見，在哺乳動(dòng)物中長鏈多不飽和脂肪酸的合成主要依靠Δ5和Δ6脂肪酸去飽和酶以及ELOVL-2和ELOVL-5脂肪酸延長酶的作用。這正是本研究選擇這 4種酶的編碼基因作為目的基因的原因。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)而在 HEK293T細(xì)胞中將這 4個(gè)基因進(jìn)行超表達(dá)后，LA和ALA轉(zhuǎn)化成為長鏈多不飽和脂肪酸的效率大大提高了，該研究結(jié)果也明確地證實(shí)了在哺乳動(dòng)物中長鏈多不飽和脂肪酸的合成主要依靠Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的作用。從我們的研究可以看出，哺乳動(dòng)物自身形成了某種平衡機(jī)制，抑制長鏈多不飽和脂肪酸如DHA、ARA等的大量的高水平合成，但是通過對Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的超表達(dá)，能夠打破哺乳動(dòng)物這種平衡機(jī)制，從而顯著提高DHA、ARA等的合成水平。至于哺乳動(dòng)物為何需要這種抑制長鏈多不飽和脂肪酸合成的機(jī)制而又要依靠食物補(bǔ)充這些重要的營養(yǎng)物質(zhì)，則需要從進(jìn)化等角度進(jìn)行深入的研究。

我們的研究還為利用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的思路提供了重要依據(jù)。如果本研究中的基因表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中也能夠達(dá)到類似的效果，則可以在動(dòng)物產(chǎn)品中獲得較高水平的長鏈多不飽和脂肪酸。另外，本研究通過對Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延長酶的超表達(dá)，能夠明顯看到DHA和EPA的增加水平遠(yuǎn)高于ARA的增加水平，說明ω-3系多不飽和脂肪酸的生物合成效率要高于ω-6系多不飽和脂肪酸的生物合成效率。根據(jù)這一點(diǎn)，可以通過優(yōu)化LA和ALA添加的比例而獲得更多的DHA和EPA等ω-3系多不飽和脂肪酸。

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