HPLC法測定烏蕨中原兒茶酸及原兒茶醛的含量

陳明+段萍+徐作剛+萬紅才

基金項(xiàng)目：貴州省衛(wèi)生廳-黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校科技聯(lián)合基金項(xiàng)目（gzwkj2013-2-006）。

作者簡介：陳明（1965-），男，副教授，主要從事藥理學(xué)及藥物分析的研究。E-mail：462050602@qq.com

通信作者：段萍（1964-），女，副主任藥師，主要從事化學(xué)藥及中成藥制劑分析的研究。E-mail：Duanping1964@163.com

【摘 要】 目的：建立烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量測定方法。方法：采用HPLC法測定，色譜柱：迪馬Diamonsil ODS C18（4.6mm×150mm，5μm）；Agilent ODS C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.4%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫；流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：5μl；柱溫30℃；檢測波長：280nm。結(jié)果：原兒茶酸在0.16176-1.2132μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.99996；平均回收率為96.70%，RSD為1.30%；原兒茶醛在0.06030-0.45225μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.99996，平均回收率為96.18%，RSD為1.10%。結(jié)論：該方法測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性好。

【關(guān)鍵詞】 HPLC；烏蕨；原兒茶酸；原兒茶醛

【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）18-0011-02

烏蕨Stenoloma chusanum（L.）Ching為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物，別名烏韭、石發(fā)、土川連、孔雀尾、大葉金花草、小葉野雞尾、蜢蚱參、細(xì)葉鳳凰尾等，分布較為廣泛，是一種常見的中草藥。其具有一定的抗菌活性，有“萬能解毒藥”之稱[1-3]。烏蕨中含有葒草苷、葒草苷-2-O-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、芹菜素、丁香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸和龍膽酸等化合物。目前采用紫外分光光度法測定烏蕨中總黃酮、總酚酸含量[4-7]。未見報(bào)道測定原兒茶酸、原兒茶醛的含量。為此，本文采用HPLC法測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀；Agilent1260高效液相色譜儀；島津2401紫外分光光度計(jì)；SK250LHC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)儀器有限公司）；梅特勒AG135、AL204電子天平。

1.2 試劑與材料 原兒茶酸（批號：0809-200604）、原兒茶醛（批號：110810-200506）對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈（色譜純）、水為娃哈哈純凈水、其余試劑均為分析純。烏蕨樣本共7批，自然干燥10天后，地下部分洗凈，全草于90℃干燥5小時(shí)，取地上部分、地下部分分別粉碎，過10目篩，即得供試樣品，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-13] 色譜柱：迪馬Diamonsil ODS C18（4.6mm×150mm，5μm）、Agilent ODS C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.4%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫， 0～20min，98%-92% A；20～35min，92%-98% A；35～40min，98% A；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：5μl；柱溫：30℃；檢測波長：280nm。理論板數(shù)以原兒茶醛峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對照品溶液配制 精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛對照品適量，加65%乙醇制成每1ml含原兒茶酸0.08mg、原兒茶醛0.03mg的溶液。

2.3 供試品溶液配制[14、15] 取供試樣品約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 峰純度考察 取對照品溶液、供試品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果表明：對照品原兒茶醛的紫外掃描圖在280nm處有最大吸收，原兒茶酸的紫外掃描圖在260nm處有最大吸收，在280nm處有較大吸收。烏蕨供試液中原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖與對照品原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖譜一致，且達(dá)到純度要求。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取原兒茶酸10.11mg置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，精密量取2ml置25ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度；原兒茶醛對照品10.05mg置100ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，精密量取3ml置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，得原兒茶酸（0.08088mg/mL）、原兒茶醛（0.03015mg/ml）對照品溶液。精密吸取原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液2、5、8、10、15μl，注入液相色譜儀，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù)（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，原兒茶酸、原兒茶醛線性回歸方程分別為：A=1731800.51C-787.30（r=0.99996）、A=46117473.35C-1951.57（r=0.99996）。且原兒茶酸在0.1618-1.213μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；原兒茶醛在0.06030-0.4522μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 精密吸取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.10%、1.06%，結(jié)果表明此方法有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16、24h進(jìn)樣，進(jìn)樣量5μl，測定原兒茶酸、原兒茶醛峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.89%、1.22%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品，按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下方法，測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g，RSD分別為1.74%、0.78%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g（原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g），置具塞錐形瓶中，精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg，置100mL量瓶中，精密量取50ml置500ml量瓶中，另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液（0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml）]50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣5μl，記錄色譜圖，另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl，同法測定。平均回收率分別為96.70%，96.18%；RSD分別為1.30%， 1.10%。結(jié)果見表2。

2.10 樣品測定 取供試樣品（地上部分與地下部分）分別配制供試品溶液，進(jìn)樣5μl，記錄峰面積，測定含量。見表3、表4。

3 討論

3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響，冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半；地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑，加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液，以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高；65%乙醇作溶劑，加熱回流與超聲各1h，加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

參考文獻(xiàn)

[1]秦仁昌.中國植物志（第2卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1959：275-279.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3]陳明，陳金秀，段萍.烏蕨的毒理學(xué)系列研究[J]，中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000，28（6）：48-50.

[4]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層層析及紫外光譜研究[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，23（6）：82-86.

[5]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層成分分析[J].海峽藥學(xué)，2006，29（1）：99-103.

[6]吳曉寧，張春椿.烏蕨不同部位總黃酮和元素的分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33（4）：587-588.

[7]陶晨，楊小生，羅載剛，等.烏蕨中抑菌活性成分核磁共振波譜分析[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29（6）：495-496.

[8]吳曉寧，張春椿，吳巧鳳.烏蕨總黃酮超聲提取工藝的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（3）：190-191.

[9]張春椿，熊耀康，顧芳芳，等.烏蕨總黃酮提取工藝研究[J].中國藥業(yè)，2008，17（2）：42-43.

[10]YBZ11072004，丹參注射液[S].

[11]何昱，成金樂，徐吉銀，等.HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA四種成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，12（4）：688-691.

[12]賈恒明，劉敏，張良，等.HPLC法測定狗脊補(bǔ)腎片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（6）：448-450.

[13]謝艷，羅銳，何智建，等.狗脊炮制工藝的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（7）：1096-1098.

[14]龔曉莉，羅婭君，史東林，等.抗菌植物烏蕨中總酚酸含量的測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28（11）：41-44.

[15]李明芳，羅婭君，李輝容.大葉金花草黃酮類化學(xué)成分的研究[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（3）：358-360.

（收稿日期：2014.07.12）

2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品，按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下方法，測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g，RSD分別為1.74%、0.78%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g（原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g），置具塞錐形瓶中，精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg，置100mL量瓶中，精密量取50ml置500ml量瓶中，另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液（0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml）]50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣5μl，記錄色譜圖，另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl，同法測定。平均回收率分別為96.70%，96.18%；RSD分別為1.30%， 1.10%。結(jié)果見表2。

2.10 樣品測定 取供試樣品（地上部分與地下部分）分別配制供試品溶液，進(jìn)樣5μl，記錄峰面積，測定含量。見表3、表4。

3 討論

3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響，冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半；地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑，加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液，以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高；65%乙醇作溶劑，加熱回流與超聲各1h，加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

參考文獻(xiàn)

[1]秦仁昌.中國植物志（第2卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1959：275-279.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3]陳明，陳金秀，段萍.烏蕨的毒理學(xué)系列研究[J]，中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000，28（6）：48-50.

[4]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層層析及紫外光譜研究[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，23（6）：82-86.

[5]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層成分分析[J].海峽藥學(xué)，2006，29（1）：99-103.

[6]吳曉寧，張春椿.烏蕨不同部位總黃酮和元素的分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33（4）：587-588.

[7]陶晨，楊小生，羅載剛，等.烏蕨中抑菌活性成分核磁共振波譜分析[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29（6）：495-496.

[8]吳曉寧，張春椿，吳巧鳳.烏蕨總黃酮超聲提取工藝的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（3）：190-191.

[9]張春椿，熊耀康，顧芳芳，等.烏蕨總黃酮提取工藝研究[J].中國藥業(yè)，2008，17（2）：42-43.

[10]YBZ11072004，丹參注射液[S].

[11]何昱，成金樂，徐吉銀，等.HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA四種成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，12（4）：688-691.

[12]賈恒明，劉敏，張良，等.HPLC法測定狗脊補(bǔ)腎片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（6）：448-450.

[13]謝艷，羅銳，何智建，等.狗脊炮制工藝的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（7）：1096-1098.

[14]龔曉莉，羅婭君，史東林，等.抗菌植物烏蕨中總酚酸含量的測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28（11）：41-44.

[15]李明芳，羅婭君，李輝容.大葉金花草黃酮類化學(xué)成分的研究[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（3）：358-360.

（收稿日期：2014.07.12）

2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品，按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下方法，測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g，RSD分別為1.74%、0.78%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測定含量的樣品1.0g（原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g），置具塞錐形瓶中，精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液[精密稱取原兒茶醛對照品10.05mg，置100mL量瓶中，精密量取50ml置500ml量瓶中，另精密稱取原兒茶酸對照品10.33mg置同一500ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對照品溶液（0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml）]50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣5μl，記錄色譜圖，另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液5μl，同法測定。平均回收率分別為96.70%，96.18%；RSD分別為1.30%， 1.10%。結(jié)果見表2。

2.10 樣品測定 取供試樣品（地上部分與地下部分）分別配制供試品溶液，進(jìn)樣5μl，記錄峰面積，測定含量。見表3、表4。

3 討論

3.1 采挖季節(jié)對烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響，冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半；地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑，加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液，以65%乙醇制備的供試品溶液所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高；65%乙醇作溶劑，加熱回流與超聲各1h，加熱回流所測原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

參考文獻(xiàn)

[1]秦仁昌.中國植物志（第2卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1959：275-279.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3]陳明，陳金秀，段萍.烏蕨的毒理學(xué)系列研究[J]，中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000，28（6）：48-50.

[4]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層層析及紫外光譜研究[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，23（6）：82-86.

[5]蔡建秀，黃艷艷，許婉珍.烏蕨黃酮類化合物薄層成分分析[J].海峽藥學(xué)，2006，29（1）：99-103.

[6]吳曉寧，張春椿.烏蕨不同部位總黃酮和元素的分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33（4）：587-588.

[7]陶晨，楊小生，羅載剛，等.烏蕨中抑菌活性成分核磁共振波譜分析[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，29（6）：495-496.

[8]吳曉寧，張春椿，吳巧鳳.烏蕨總黃酮超聲提取工藝的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（3）：190-191.

[9]張春椿，熊耀康，顧芳芳，等.烏蕨總黃酮提取工藝研究[J].中國藥業(yè)，2008，17（2）：42-43.

[10]YBZ11072004，丹參注射液[S].

[11]何昱，成金樂，徐吉銀，等.HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA四種成分的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，12（4）：688-691.

[12]賈恒明，劉敏，張良，等.HPLC法測定狗脊補(bǔ)腎片中原兒茶酸和原兒茶醛的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（6）：448-450.

[13]謝艷，羅銳，何智建，等.狗脊炮制工藝的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（7）：1096-1098.

[14]龔曉莉，羅婭君，史東林，等.抗菌植物烏蕨中總酚酸含量的測定[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28（11）：41-44.

[15]李明芳，羅婭君，李輝容.大葉金花草黃酮類化學(xué)成分的研究[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（3）：358-360.

（收稿日期：2014.07.12）