丹參酮ⅡA磺酸鈉對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的抗炎作用及其機制研究

石亮亮 劉明東 朱 浩 陳 敏 鄒曉平

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種臨床常見的急腹癥，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)可導致全身性炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)，是造成SAP高死亡率的重要原因［1-2］。SAP相關肺損傷的發(fā)生率約為15% ～55%［3］，急性肺損傷是SAP早期最主要的死亡原因，然而其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是AP發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵介質之一，炎癥因子可激活JNK信號通路，而該通路激活又可進一步加重炎癥反應［4］。丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS)是中藥丹參提取物丹參酮ⅡA的水溶性衍生物，既往研究發(fā)現(xiàn)該制劑能阻斷JNK信號通路激活［5］，并對急性肺損傷具有保護作用［6］。本研究建立急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠模型并予STS預處理，通過觀察ANP大鼠的肺組織損傷程度、炎癥因子表達和JNK信號通路的活化情況，探討STS對SAP相關肺損傷的抗炎作用及其可能機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質量200～250 g，由南京鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供。STS注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準字 H31022558)，大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(Bender MedSystems，eBioscience Inc.)，兔抗大鼠 SAPK/JNK、Phospho-SAPK/JNK單克隆抗體(Cell Signaling Technology，Inc.)，抗 GAPDH 兔多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)，山羊抗兔 IgG(Molecular Probes?，Thermo Fisher Scientific Inc.)。

二、方法

1.動物分組和ANP模型制備:實驗動物隨機分為假手術組、ANP組和STS組，每組12只。ANP組和STS組予新鮮配制的5%牛磺膽酸鈉(1.0 mL/kg)從十二指腸乳頭處逆行穿刺注入主胰管建立ANP模型，假手術組開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次后關腹。STS組于造模前30 min予腹腔注射 STS 1.0 mg/kg預處理［6］。造模后 12 h 和 24 h分批處死動物，進行后續(xù)實驗。

2.常規(guī)病理學檢查:取大鼠胰腺組織和部分右肺組織，4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

3.肺損傷評分［7］:根據(jù)肺組織水腫、出血、炎性細胞浸潤和小氣道損傷四項病理變化進行評分，每項變化按程度分為5級。0級:無該項病理變化;1級:病理變化輕且很局限;2級:病理變化中等且局限;3級:病理變化中等但廣泛或局部很顯著;4級:非常顯著的廣泛性病理變化。

4.肺組織促炎細胞因子含量測定:取部分右肺組織制成5%勻漿，－20℃保存待測。采用ELISA方法，按試劑盒說明書進行操作，測定肺組織TNF-α、IL-1β 含量。

5.蛋白質印跡法檢測肺組織JNK、p-JNK蛋白表達:制備肺組織勻漿，提取總蛋白并進行蛋白定量。取50 μg總蛋白，按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，含5%奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗(1∶1000)4℃過夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入 ECL發(fā)光液，顯影，定影，掃描膠片，Quantity One軟件分析各條帶光密度值，計算目的蛋白相對表達量。每一樣本至少重復檢測3次。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、胰腺和肺組織病理學改變

假手術組大鼠胰腺和肺組織結構基本正常。ANP 12 h組胰腺腺泡間隙明顯擴大，小葉結構破壞，細胞結構模糊，邊界不清，胰腺內出現(xiàn)片狀壞死、出血，大量中性粒細胞浸潤;24 h組胰腺壞死區(qū)域進一步擴大，中性粒細胞浸潤相對減輕。STS組胰腺組織損傷較ANP組減輕，壞死面積減小，可見點狀出血。ANP 12 h組肺組織肺泡壁增厚，間隔增寬，間質毛細血管充血、淤血，大量中性粒細胞浸潤;24 h組肺組織實變更為明顯。STS組肺組織損傷較ANP組減輕，實變面積減小，炎性細胞浸潤減輕(見圖1)。

圖1 ANP組和STS組造模后24 h肺組織病理學改變(HE染色，×200)

二、肺損傷評分

ANP 12 h組和24 h組肺組織水腫、出血、白細胞浸潤和小氣道損傷的病理學評分均顯著高于同時間點假手術組(P＜0.05);STS組與同時間點ANP組相比，各項病理學評分均顯著降低(P＜0.05)(見表1)。

三、肺組織 TNF-α、IL-1β 表達

ELISA法檢測顯示，ANP 12 h組和24 h組肺組織TNF-α、IL-1β含量均顯著高于同時間點假手術組(P＜0.05);STS組與同時間點ANP組相比，TNF-α、IL-1β 含量均顯著降低(P ＜0.05)(見表1)。

四、肺組織JNK、p-JNK蛋白表達

蛋白質印跡法檢測顯示，ANP 12 h組和24 h組肺組織JNK及其活化形式p-JNK蛋白相對表達量均顯著高于同時間點假手術組(P＜0.05);STS組與同時間點ANP組相比，JNK表達無明顯變化，p-JNK表達顯著降低(P ＜0.05)(見圖2、表1)。

討 論

除胰腺和胰周壞死外，SAP患者還伴有持續(xù)且不能自行恢復的呼吸、心血管或腎臟功能衰竭，可累及一個或多個臟器［8］，病死率高達36% ～50%。急性肺損傷及其引起的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是SAP最常見的胰外表現(xiàn)，使SAP早期死亡率明顯增高［3］。SAP相關肺損傷發(fā)生機制復雜，有多種黏附分子、炎癥介質參與其間，但確切機制迄今仍未闡明，因此尚無針對病因的有效治療措施，減輕肺損傷可能降低SAP的死亡率。

圖2 三組各時間點肺組織JNK、p-JNK蛋白表達電泳圖

MAPKs廣泛存在于哺乳動物細胞的胞質中，參與調節(jié)細胞生長、發(fā)育、分化、死亡以及細胞間功能的同步等一系列生命活動。JNK是MAPKs家族的重要成員之一，可被應激刺激、細胞因子、生長因子等激活。研究發(fā)現(xiàn)在多種因素誘導的肺損傷動物模型中，炎癥因子如TNF-α、IL-1等引起的 JNK信號通路激活可通過上調激活蛋白-1(AP-1)的轉錄活性，調控一系列炎癥相關基因表達，促進肺損傷發(fā)生［9-14］。因此，JNK信號通路是肺損傷炎癥反應的重要介質之一，炎癥因子激活JNK信號通路，該通路激活又使炎癥反應進一步放大。本課題組前期研究［15］證實JNK信號通路在SAP相關肺損傷中起關鍵作用，由此推測JNK特異性抑制劑可能有助于減輕SAP相關肺損傷。

表1 三組各時間點肺損傷評分、肺組織促炎細胞因子和JNK、p-JNK蛋白表達比較(n=6，)

表1 三組各時間點肺損傷評分、肺組織促炎細胞因子和JNK、p-JNK蛋白表達比較(n=6，)

a與同時間點假手術組比較，P＜0.05;b與同時間點ANP組比較，P＜0.05

本實驗對ANP小鼠肺組織的組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)肺組織內中性粒細胞浸潤明顯，毛細血管通透性增加，肺損傷評分明顯增高。中性粒細胞進入肺組織并被激活產生促炎細胞因子在肺損傷中起關鍵作用，其中IL-1是細胞因子網絡中最早釋放的炎癥介質之一，而TNF-α可誘導單核因子如IL-1β、IL-6合成，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，增強其破壞性［16］。本實驗對ANP小鼠肺組織的檢測顯示，造模后12 h和24 h，肺組織TNF-α、IL-1β 含量均明顯增高，同時JNK、p-JNK表達上調，提示炎癥因子激活JNK信號通路。進一步觀察經STS預處理的ANP小鼠，發(fā)現(xiàn)該組小鼠肺組織JNK表達無明顯變化，但p-JNK表達明顯下調，提示JNK信號通路活化受抑，同時肺組織TNF-α、IL-1β含量和肺損傷評分均明顯降低，提示STS可能通過抑制JNK信號通路激活而在SAP相關肺損傷中發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，SAP相關肺損傷有JNK信號通路參與其中，STS干預能下調ANP大鼠的肺組織炎癥因子表達，降低肺損傷程度，其機制可能與抑制JNK信號通路激活有關。本實驗的缺陷之處在于未能對STS的適宜劑量進行探討，有待后續(xù)研究加以完善。

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