脫氧膽酸在人結(jié)腸癌細胞株HCT116遷移和侵襲中的作用及其機制研究

趙會君 孔 炫 房靜遠

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中居第四位［1］。動物脂肪攝入量增加是促進結(jié)直腸癌形成的重要因素［2］。動物脂肪攝入量增加可促進膽汁酸分泌，導致體內(nèi)次級膽汁酸含量增加。脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)是參與腸肝循環(huán)的一種次級膽汁酸，研究［3］顯示結(jié)直腸癌患者糞便中的DCA含量明顯高于健康人，且DCA含量升高的結(jié)直腸癌患者腫瘤復發(fā)風險顯著增加。Yui等［4］的研究顯示，DCA可誘導結(jié)腸上皮細胞DNA損傷、線粒體破壞，促進結(jié)腸上皮細胞凋亡，并可引起細胞基因組不穩(wěn)定性，導致基因突變增加，進而促進結(jié)腸癌發(fā)生。Da Silva等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，DCA在體外可通過激活蛋白激酶B和p38，促進ERK1/2磷酸化，誘導結(jié)腸癌細胞增殖。DCA是生理狀態(tài)下體內(nèi)長期存在的代謝分子，然而目前研究多為以高濃度DCA短時間刺激細胞，采用長時間慢性刺激的研究甚少。本研究以DCA長時間刺激人結(jié)腸癌細胞株HCT116，探討DCA在結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲中的作用及其機制，以期為結(jié)直腸癌的防治提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細胞株HCT116購自American Type Culture Collection(ATCC)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中(37℃，5%CO2)。DCA、DMSO購自Sigma公司，CCK-8試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司，Transwell小室購自Millipore公司，Bradford蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)抗體、鼠抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)抗體、兔抗人維生素D受體(VDR)抗體購自Abcam公司，GAPDH抗體、HRP標記的羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗購自上?？党缮锕こ逃邢薰荆珽CL試劑盒購自Pierce公司。

二、方法

1.細胞增殖率檢測:取對數(shù)生長期HCT116細胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，更換為無血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，分別以含DCA 12.5、50、200 μmol/L 和 DMSO 的培養(yǎng)基處理細胞0、12、24、36 h，吸除培養(yǎng)基，加入 100 μL 無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)2 h，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞增殖率(%)=(實驗孔A值-空白孔A值)/(陰性對照孔A值-空白孔A值)×100%，根據(jù)細胞增殖率繪制生長曲線。

2.細胞遷移能力檢測:取對數(shù)生長期HCT116細胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，以含 DCA 12.5 μmol/L的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，以含DMSO的培養(yǎng)基作為陰性對照組。培養(yǎng)3 d后消化細胞，接種于6孔板培養(yǎng)24 h，待細胞密度達到100%，以無菌黃色Tip頭于6孔板內(nèi)劃痕，PBS沖洗，加入含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，顯微鏡下多位點拍照，4 d后再次拍照觀察劃痕愈合情況。

3.細胞侵襲能力檢測:細胞培養(yǎng)同遷移能力檢測。培養(yǎng)5 d后消化細胞，以含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的無血清培養(yǎng)基重懸細胞至1.0×106/mL。以經(jīng)無血清培養(yǎng)基稀釋的 Matrigel基質(zhì)膠(1∶3)包被Transwell小室底部膜的上室面，待基質(zhì)膠稀釋液聚合成凝膠，取細胞懸液200 μL加入小室，下室加入含30%胎牛血清和DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后取出小室，以棉簽擦除小室聚碳酸酯膜上表面細胞和凝固的基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定 15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，倒置顯微鏡下觀察并任意選取5個視野(×20)計數(shù)聚碳酸酯膜下表面細胞，結(jié)果取均值。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測E-cad、N-cad、VDR蛋白表達:取對數(shù)生長期HCT116細胞，分別以含DCA 12.5 μmol/L的培養(yǎng)基處理 1、3、7、14、28 d，或以含DMSO的培養(yǎng)基處理28 d，收集細胞提取總蛋白，以Bradford法行蛋白定量。每一樣本取100 μg蛋白上樣，行10%變性SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入兔抗人E-cad抗體(1∶200)、鼠抗人N-cad抗體(1∶500)、兔抗人VDR抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶5000)，4℃過夜，TBST洗膜，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶5000)或兔抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、HCT116細胞增殖率

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，經(jīng) 12.5、50、200 μmol/L DCA作用36 h的 HCT116細胞，細胞增殖率較DMSO組明顯升高，以12.5 μmol/L組升高最為顯著(P＜0.05)(見圖1)。

二、HCT116細胞遷移力和侵襲力

劃痕實驗結(jié)果顯示，經(jīng)12.5 μmol/L DCA作用7 d的HCT116細胞，細胞遷移力較DMSO組明顯增強(見圖2);Transwell實驗結(jié)果顯示，該組細胞侵襲力亦較DMSO組顯著增強(P＜0.01)(見圖3)。

圖1 不同濃度、不同時間DCA處理組HCT116細胞增殖率比較

圖2 12.5 μmol/L DCA處理對 HCT116細胞遷移力的影響(劃痕實驗)

三、E-cad、N-cad、VDR 蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，DCA組E-cad和N-cad表達水平隨DCA作用時間的延長而升高，第28 d時明顯高于DMSO組;DCA組VDR表達水平在第1 d時較DMSO組有所上升，其后呈下降趨勢，第28 d時較DMSO組明顯降低(見圖4)。

圖 4 12.5 μmol/L DCA 處理對 HCT116 細胞 E-cad、N-cad、VDR表達的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

DCA是參與腸肝循環(huán)的次級膽汁酸，作為一種誘導結(jié)直腸癌發(fā)生的代謝產(chǎn)物，近年來在人群流行病學和基礎(chǔ)研究方面得到廣泛關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)DCA可促進結(jié)腸癌細胞增殖，然而其在結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲中的作用尚未明確。本研究以不同濃度DCA刺激人結(jié)腸癌細胞株HCT116，證實DCA可促進HCT116細胞增殖，濃度為12.5 μmol/L時效應(yīng)較 50、200 μmol/L 顯著，因此以12.5 μmol/L作為理想劑量進行后續(xù)研究。

腫瘤遠處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。本研究通過以DCA刺激HCT116細胞較長時間，探討DCA對HCT116細胞遷移力和侵襲力的影響，結(jié)果顯示經(jīng)DCA作用7 d的HCT116細胞，細胞遷移力和侵襲力顯著增強。進一步以DCA作用于HCT116 細胞 1、3、7、14、28 d，研究 DCA 對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)標記物E-cad、N-cad表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者表達水平隨DCA作用時間的延長而升高，第28 d時明顯高于DMSO組。E-cad是維系細胞間緊密連接的鈣連接蛋白，在EMT過程中表達減少或缺失，而N-cad在EMT過程中表達增加，該變化可促進癌細胞遷移［6］。然而有學者指出，細胞在經(jīng)歷EMT時，并非所有的EMT標記物均會發(fā)生變化［7］。Nieman等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，在E-cad未發(fā)生明確變化的情況下，N-cad可促進人乳腺癌細胞遷移和侵襲。Cho等［9］對肝細胞癌的研究顯示，N-cad不僅能促進癌細胞侵襲，還可促進癌細胞增殖，并抑制其凋亡。由此可見，本研究中N-cad表達水平升高即可證實DCA對結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲具有促進作用，而E-cad表達水平升高在此過程中的作用有待進一步明確。

圖3 12.5 μmol/L DCA處理對HCT116細胞侵襲力的影響(Transwell實驗，×20)

VDR是腸道上皮細胞的核受體之一，可通過抑制Wnt/β-catenin通路，阻止結(jié)直腸癌早期惡性演變，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用［10］。研究［11-12］顯示，約90%的結(jié)直腸癌患者存在VDR表達下調(diào)，低分化結(jié)直腸癌組織的VDR表達水平較高分化結(jié)直腸癌組織降低。EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1、SNAIL2可抑制VDR表達，而VDR可促進E-cad表達［13-14］。本研究結(jié)果顯示，DCA作用于HCT116細胞后，VDR表達水平呈雙向變化，在短時間內(nèi)(第1 d)呈上升趨勢，但3、7、14、28 d 后呈下降趨勢，推測DCA作用后VDR表達在短時間內(nèi)升高可能是細胞為適應(yīng)并抑制DCA的毒性作用而產(chǎn)生的反應(yīng)性調(diào)節(jié)，但后期該調(diào)節(jié)作用減弱，VDR表達呈下降趨勢，促進結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲。

綜上所述，DCA可促進結(jié)腸癌細胞增殖，且較長時間(7 d)的DCA刺激能顯著增強結(jié)腸癌細胞的遷移力和侵襲力，其機制可能與上調(diào)N-cad表達和下調(diào)VDR表達有關(guān)，然而具體作用機制仍未完全明確，有待后續(xù)進一步深入研究。

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