雞冠花乙醇提取物的HPLC指紋圖譜研究

張海晶，金 蘭，于金平，陳大忠

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

雞冠花為莧科(Amaranthaceae)青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序［1］，該植物在世界各地分布廣泛，資源豐富.其藥用歷史悠久，是我國一味傳統(tǒng)的中藥，在抗糖尿?。?］、抗陰道毛滴蟲、止血、抗衰老及保肝等作用［3－7］等方面具有很好的藥理活性.然而，對于該藥材的質(zhì)量控制的報道極少見，甚至沒有.中藥指紋圖譜是運用現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學(xué)信息以圖形的方式進(jìn)行表征并加以描述，憑借其準(zhǔn)確性和可操縱性已經(jīng)成為國際公認(rèn)的中藥或天然藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的最有效手段之一.HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、流動相選擇性廣等特點，非常適合構(gòu)建中藥指紋圖譜.HPLC指紋圖譜是目前國際上認(rèn)可的一種中藥質(zhì)量評價模式，可以通過把握中藥指紋的特征，評價中藥材的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，是建立中藥現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心技術(shù).本文對雞冠花的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了探討，并對其研究方法學(xué)進(jìn)行考察，從而為該藥材的質(zhì)量控制提供一個更為可行的依據(jù).

1 實驗材料

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 2996二極管陣列檢測器，Waters Empower Pro色譜工作站)，Dikma C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);LA204電子分析天平(瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司);KQ－2500E超聲清洗機(jī).乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;山奈酚對照品(MUST－10102801，中國食品藥品檢定研究院)、槲皮素對照品(100081－200406中國食品藥品檢定研究院)、木犀草素對照品(111520－200504，中國食品藥品檢定研究院).

雞冠花分別收集于黑龍江、湖南、河北、吉林等地，共10批，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫慧峰教授鑒定為莧科青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.).標(biāo)本(20110912)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院.

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Dikma C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃，檢測波長:260 nm，分析時間:90 min，進(jìn)樣量:20 μL.

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取山奈酚、槲皮素、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別加甲醇充分溶解，定容于10 mL的容量瓶中，過0.45μm濾膜過濾后作為對照品溶液.

2.3 供試品溶液制備

將曬干的雞冠花藥材粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，稱取干燥粉末5.0 g，加入95%的乙醇50 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲提取60 min.放冷，再稱定質(zhì)量，并用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，溶液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積.結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD為0.02%～0.76%，RSD ＜1%，相對峰面積 RSD 為0.07%～1.38%，RSD＜3%，表明儀器性能良好，符合指紋圖譜的要求.

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)樣檢測，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積.結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD為0.02% ～0.39%，RSD＜1%，相對峰面積RSD為0.14% ～1.84%，RSD＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.4.3 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一批樣品6份，制備供試品溶液進(jìn)行分析，方法同以上實驗.結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD為0.03% ～0.53%，RSD＜1%，相對峰面積RSD為0.41% ～2.24%，RSD＜3%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性結(jié)果，符合指紋圖譜要求.

3 實驗結(jié)果

3.1 雞冠花指紋圖譜的建立

分別將對照品溶液及10批雞冠花供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按確定的上述色譜條件進(jìn)行測定，并記錄90 min內(nèi)的色譜圖.在10批樣品的指紋圖譜中，其相對保留時間及色譜峰較穩(wěn)定的峰有16個，確定為雞冠花共有峰，即1～16號峰.通過與對照品對照，指認(rèn)了其中3個化合物色譜峰.即9號峰為木犀草素;10號峰為槲皮素;13號峰為山奈酚.具體見圖1、2.

3.2 指紋圖譜相似度評價

根據(jù)10批雞冠花的HPLC圖譜，并以1號藥材譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配，S峰為內(nèi)參比峰計算相對保留時間及峰面積.將所得的AIA格式色譜圖依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》(研究版)軟件，輸出了10批雞冠花指紋圖譜及雞冠花對照指紋圖譜，并以此為基準(zhǔn)，進(jìn)行相似度計算，結(jié)果10批不同產(chǎn)地的雞冠花藥材的相似度均大于0.9.具體見圖3.

圖1 樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較

圖2 雞冠花指紋圖譜共有模式圖

圖3 不同產(chǎn)區(qū)雞冠花HPLC指紋圖譜

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

利用Waters 2695－2996高效液相色譜儀，進(jìn)行全波長掃描，本著色譜信息豐富、出峰的數(shù)目適中且各峰之間分離度好的原則，確定260 nm為其檢測波長.

4.2 流動相的確定

本實驗分別考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.1%磷酸水溶液4種系統(tǒng)，并分別以不同的梯度進(jìn)行洗脫，記錄色譜圖.結(jié)果表明，乙腈－0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，色譜峰信息較多，分離效果好，且基線平穩(wěn).乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫:0～15 min，5% ～20%A;15～35 min，20% ～30%A;35～45 min，30% ～40%A;45 ～60 min，40% ～65%A;60～70 min，65% ～85%A;70 ～90 min，85% ～100%A.

4.3 提取溶劑的考察

本實驗選擇了5種溶劑超生提取進(jìn)行比較，包括50%甲醇、100%甲醇、水、65%乙醇、95%乙醇.結(jié)果表明，不同的溶劑提取所得到的色譜圖的差別較大，水提得到的色譜圖峰數(shù)較少，50%甲醇和65%乙醇提取得到的色譜圖基本類似，100%甲醇和95%乙醇提取得到的色譜圖基本類似，但是95%乙醇提取得到的色譜圖的峰分離較好，并且基線較平穩(wěn)，故選擇95%乙醇作為提取溶劑.

5 結(jié)語

本實驗采用高效液相色譜法對不同產(chǎn)地雞冠花進(jìn)行指紋圖譜研究，以多種化學(xué)成分的保留時間和峰面積為參數(shù)進(jìn)行整體考察并計算其相似度，建立了不同產(chǎn)區(qū)雞冠花的指紋圖譜并生成雞冠花特征指紋圖譜.通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)軟件對10批不同產(chǎn)地雞冠花指紋圖譜比較分析，確定10批樣品有16個特征指紋峰，各共有峰的相對保留時間穩(wěn)定，但相對峰面積不同，表示不同產(chǎn)地所含的化學(xué)成分種類相似，但各成分的含量有所差異.10批雞冠花樣品與共有模式的相似度均大于0.9，表明本實驗所建立的指紋圖譜特征性較強、穩(wěn)定性較好，可為雞冠花藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)的依據(jù)和有效的鑒別方法.

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