響應(yīng)面優(yōu)化白芷總香豆素提取工藝的研究

藍(lán)耀宏

（廣 西南寧地區(qū)教育學(xué)院，廣西 南寧 530001）

白芷（學(xué)名Angelica dahurica）為傘形科當(dāng)歸屬植物，化學(xué)成分含揮發(fā)油，香豆素及其衍生物等。白芷具有消散排膿、祛風(fēng)解表、燥濕止帶、宣通鼻竅及祛風(fēng)止痛等功效[1]。文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，白芷中的香豆素類化合物是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的主要成分，其中主要包括有歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素等成分[2]。

鑒于白芷的藥用價(jià)值，展開對(duì)白芷藥效成分提取工藝的研究十分必要。目前用于白芷總香豆素的提取工藝主要有CO2超臨界萃取法、乙醇提取法、超聲法、滲漉法等[2-6]。鑒于乙醇提取工藝操作便捷、提取率高、有效成分熱損失小等優(yōu)點(diǎn)[7]，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究乙醇提取工藝中乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比對(duì)白芷總香豆素提取量的影響，并根據(jù)Box-Behnken原理及響應(yīng)面法構(gòu)造模型分析3個(gè)因素對(duì)白芷乙醇提取工藝的影響，最終優(yōu)化并確定白芷總香豆素的乙醇提取工藝，以期為白芷提取工藝工業(yè)化生產(chǎn)提供最優(yōu)工藝參數(shù)參考。

1 儀器與試驗(yàn)藥劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

DR5000臺(tái)式紫外可見分光光度計(jì)，YP302N電子天平，R206D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

白芷（外購(gòu)，經(jīng)鑒定為傘形科植物白芷的干燥根）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純），95%乙醇（分析純），歐前胡素對(duì)照品。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測(cè)定白芷總香豆素含量

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱量歐前胡素對(duì)照品5.35 mg，用甲醇定容至50 mL，即得0.107 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液器精密量取對(duì)照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0 mL各置于100 mL 容量瓶，并用甲醇稀釋定容，最后制得系列濃度分別為0.535、1.07、1.605、2.140、2.675、3.210、3.745、5.35 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，在300nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度對(duì)照品溶液的吸光度值，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：A=0.0416C+0.1639，R2=0.9991。結(jié)果顯示，歐前胡素對(duì)照品在0.500～13.38 μg·mL-1測(cè)定濃度內(nèi)具有較好線性。

2.1.3 樣品溶液的含量測(cè)定

圖1 歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Imperatorin

精密量取樣品提取液5mL，用甲醇定容至50mL。300nm處測(cè)定樣品吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白芷總香豆素的含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取率的影響

白芷粉末20g，過(guò)0.42mm篩。以固液比1∶6、提取時(shí)間4h作為提取參數(shù)，分別以5%、25%、45%、65%、85%體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取白芷3次，濃縮液體積為10mL。白芷的提取量以3次均值計(jì)算。乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取量的影響結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取率具有一定影響，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，當(dāng)使用65%的乙醇進(jìn)行提取時(shí)，白芷香豆素提取率達(dá)到7.923mg·g-1。

圖2 乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on yield

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)白芷香豆素提取率的影響

白芷粉末20g，過(guò)0.42mm篩。按乙醇濃度65%，固液比1∶6為提取參數(shù)，提取時(shí)間按1h、2h、4h、6h、8h提取白芷3次，提取量濃縮至 100mL，白芷提取量以3次提取量的均值計(jì)算。乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取量的影響結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，提取時(shí)間對(duì)白芷香豆素提取率具有一定影響，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為6h時(shí)，白芷香豆素提取率達(dá)到8.538mg·g-1。

圖3 提取時(shí)間對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.3 Effects of extracting time on yield

2.2.3 固液比對(duì)白芷香豆素提取率的影響

圖4 固液比對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.4 Effects of Solid-liquid ratio on yield

白芷粉末20g，過(guò)0.42mm篩。按乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取時(shí)間4h為提取參數(shù)，分別以固液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6乙醇提取白芷3次，將提取液濃縮至100mL，提取量以均值計(jì)算。乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取量的影響結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，固液比對(duì)白芷香豆素提取率具有一定影響，提取率隨固液比的增加先升高后降低，當(dāng)固液比為1∶4時(shí)，白芷香豆素提取率達(dá)到8.778mg·g-1。

2.3 白芷香豆素提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

2.3.1 因素的選取及方案

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選取影響白芷香豆素提取率的提取時(shí)間、乙醇濃度、固液比3個(gè)因素作為考察因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法確定最佳提取工藝條件，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface metho dology

以 A、B和 C為自變量，以白芷香豆素提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，試驗(yàn)1～12是析因試驗(yàn)，試驗(yàn)13～17是中心試驗(yàn)。

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

表3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表。由表3可知，提取時(shí)間和乙醇濃度的交互作用極為顯著。此外乙醇濃度和固液比的交互作用較為顯著，由此可知各因素對(duì)白芷香豆素提取率的影響次序?yàn)椋禾崛r(shí)間和乙醇濃度的交互項(xiàng)、乙醇濃度和固液比的交互項(xiàng)、乙醇濃度一次項(xiàng)。

由于各因素對(duì)白芷香豆素提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，為了更明確各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，采用軟件Design Expert8.0.7.1對(duì)表2中白芷香豆素提取率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得回歸方程為：

白芷香豆素提取率/mg·g-1=8.61+0.025×A-0.11×B+0.070×C-0.94×A×B+0.11×A×C×0.025+0.18×B×C-0.3×A2-0.046×B2-0.92×C2

由表3的分析結(jié)果可知，整體模型極為顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface methodology

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis table of test results

2.3.3 試驗(yàn)因子的交互影響

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的

圖5 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.5 Response surface plots of ethanol concentration and extracting time on the yield of Angelica dahurica

圖6為提取時(shí)間和固液比白芷香豆素的影響，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，由圖6的曲面圖可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，白芷香豆素?zé)o明顯變化，由圖6的3D曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地解讀最佳參數(shù)及各因子之間的交互作用。當(dāng)特征值（0，1，-1）均是正值時(shí)曲面圖為山谷形，有極小值存在；當(dāng)特征值是負(fù)值時(shí)為山丘形響應(yīng)面分析圖，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)為馬鞍形曲面無(wú)極值存在[8]；等高線的形狀用于客觀反映試驗(yàn)因子交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形代表因子交互顯著，圓形則不顯著。采用Design Expert8.0.7.1軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5、圖6和圖7所示。

圖5為提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)白芷香豆素提取率(mg·g-1)的影響，當(dāng)固液比為1∶5時(shí)，由圖5的曲面圖可知隨著提取時(shí)間和乙醇濃度的延長(zhǎng)提取率增加，由圖5的等高線圖表現(xiàn)為橢圓形可知，提取時(shí)間與乙醇濃度的交互作用極為顯著。等高線圖為圓形可知，提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用不顯著。

圖6 提取時(shí)間與固液比對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.6 Response surface plots of extracting timeand and Solid-liquid ratio on the yield of Angelica dahurica

圖7為乙醇濃度與固液比白芷香豆素的影響。提取時(shí)間為6h時(shí)，由圖7的曲面可知提取溫度對(duì)白芷香豆素影響較小，由圖7的等高線圖為橢圓形可知乙醇濃度與固液比白芷香豆素交互作用較為顯著。

2.3.4 提取工藝條件的確定。

由響應(yīng)面的分析可知，回歸模型存在白芷香豆素提取率最大值8.610 mg·g-1，最高點(diǎn)位于試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，其最佳點(diǎn)位于ABC(0.11957，-0.04761，0.0356)即提取時(shí)間為4.23h，乙醇濃度為62.1%，固液比為1∶3.82。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行白芷香豆素提取率的提取試驗(yàn)，在此條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)，白芷香豆素平均提取率為8.618mg·g-1，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，這說(shuō)明回歸方程能夠真實(shí)地反映篩選因素對(duì)白芷香豆素提取率的影響,對(duì)于白芷香豆素提取工藝的研究具有指導(dǎo)意義。

圖7 乙醇濃度與固液比對(duì)白芷香豆素提取率的影響Fig.7 Response surface plots of ethanol concentration and and Solid-liquid ratio on the yield of Angelica dahurica

3 結(jié)論與討論

白芷香豆素單因素試驗(yàn)表明，白芷香豆素提取的適宜工藝條件為：固液比1∶5，提取時(shí)間6h，乙醇濃度為65%。通過(guò)響應(yīng)面分析，各個(gè)因素對(duì)白芷香豆素提取率的影響為：提取時(shí)間和乙醇濃度的交互項(xiàng)、乙醇濃度和固液比的交互項(xiàng)、乙醇濃度一次項(xiàng)。通過(guò)嶺脊法分析得到提取的最佳工藝條件為：提取時(shí)間4.23h，乙醇濃度為62.1%，固液比為1∶3.82，與理論值基本相符。與其他提取工藝相比，乙醇提取能夠較好保存有效成分，特別對(duì)熱敏性有效成分的保護(hù)具有顯著性優(yōu)勢(shì)。

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