阿霉素加熱化療對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的抑制作用研究

侯敬申+侯敬俠+王偉雄+等

[摘要] 目的 探討阿霉素加熱化療對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的抑制作用。方法 選擇體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HHCC及HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用10%胎牛血清培養(yǎng)液配制成細(xì)胞密度5×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種于50mL的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞分為3組，分別進(jìn)行單純加熱、單純化療、加熱化療處理；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 HHCC及HepG2細(xì)胞增殖抑制率3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；加熱化療組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單純加熱組及單純化療組（P<0.05）；HHCC及HepG2細(xì)胞凋亡率三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），加熱化療組細(xì)胞凋亡率明顯高于單純加熱組及單純化療組（P<0.05）。 結(jié)論 加熱化療可明顯增強(qiáng)阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對(duì)臨床治療有借鑒意義。

[關(guān)鍵詞] 阿霉素；熱化療；人肝癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）12-11-03

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡腫瘤之一，在惡性

腫瘤死亡順位中占第2位，其致死率在城市人群中僅次于肺癌；農(nóng)村人群中僅次于胃癌。但是原發(fā)性肝癌早期癥狀不明顯，臨床出現(xiàn)典型癥狀時(shí)大多處于晚期，且病情進(jìn)展較快，治療難度較大，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，或喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，患者短期內(nèi)死亡[1]。因此提高肝癌尤其是晚期肝癌的藥物治療水平對(duì)改善患者病情，延長(zhǎng)患者生存期有重要意義。熱療是近年興起的一種新的腫瘤治療方法，大量臨床研究顯示熱療對(duì)化療或放療有明顯的增效作用，部分腫瘤患者熱化療后其完全緩解率可提高1倍左右[2]。本文研究加熱化療對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的抑制作用，為肝癌的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌HHCC及HepG2細(xì)胞由本院腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供，采用含10%牛血清的培養(yǎng)液保存。阿霉素購(gòu)自輝瑞制藥有限公司，多孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自上海研拓生物科技有限公司，電熱恒溫水浴箱購(gòu)自蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HHCC及HepG2細(xì)胞均采用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，用10%胎牛血清培養(yǎng)液配制成細(xì)胞密度5×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種于50mL培養(yǎng)瓶中。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示阿霉素作用于HHCC細(xì)胞及HepG2細(xì)胞時(shí)24h IC50的藥物濃度分別為7.0mg/L，2.0mg/L[3]，本文以此濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。熱化療組及化療組HHCC及HepG2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入對(duì)應(yīng)濃度的阿霉素，單純熱療組培養(yǎng)瓶加入等量空白對(duì)照液；化療組放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，而熱化療組及單純熱療組放入電熱恒溫水浴箱進(jìn)行加熱，溫度設(shè)定為43℃，上下浮動(dòng)不超過(guò)0.1℃，加熱時(shí)間為60min，加熱后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定（MTT法） 取常規(guī)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（對(duì)照組）及經(jīng)過(guò)上述處理的細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出培養(yǎng)板，棄MTT液，每孔加入DMSO 150μL，微量震蕩后，將培養(yǎng)板置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀，測(cè)定每孔OD值，以（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)處理后，取樣，配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度5×105/mL，取1mL，采用PBS溶液洗滌2次后加入Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑，避光保存1h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)，以Cell quest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

熱療是近年興起的一種新的腫瘤治療方法，大量臨床研究顯示熱療對(duì)化療或放療有明顯的增效作用，部分腫瘤患者熱化療后其完全緩解率可提高1倍左右。德國(guó)醫(yī)學(xué)專家2009年的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，在治療癌癥患者時(shí)使用熱療和化療相結(jié)合的方法比單一接受化療效果更好，無(wú)瘤期更長(zhǎng)[4]。但是加熱與化療聯(lián)合作用的具體機(jī)制尚未完全明確，加熱本身會(huì)影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)及腫瘤局部血流分布情況，并且不同加熱溫度及化療劑量會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)造成不同影響[5]。

目前研究認(rèn)為熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用與熱療穩(wěn)定及作用時(shí)間有關(guān)，而化療對(duì)腫瘤的抑制作用主要與藥物劑量有關(guān)。對(duì)于某種特定的藥物而言，熱療與化療的協(xié)同作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）熱療能夠腫瘤內(nèi)部血流灌注，同時(shí)損害腫瘤細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部血液內(nèi)藥物含量增加，同時(shí)由于細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低，藥物更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮殺滅作用[6]。（2）熱療能夠改變腫瘤細(xì)胞外部環(huán)境，使外部pH降低，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性增加，并且pH降低利于化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接損傷[7-8]；（3）對(duì)于部分熱敏感性細(xì)胞，熱療能直接導(dǎo)致一部分腫瘤細(xì)胞DNA或RNA損傷。

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用；其主要機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或分裂停滯[9-14]。本研究結(jié)果顯示單純化療或熱療對(duì)肝癌HHCC及HepG2細(xì)胞均有一定程度的抑制作用，但是加熱化療組HHCC及HepG2細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率明顯高于上述兩組，說(shuō)明熱療與化療在抑制HHCC及HepG2細(xì)胞增殖方面有明顯的協(xié)同作用。endprint

綜上所述，加熱化療可明顯增強(qiáng)阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對(duì)臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-03-30）endprint

綜上所述，加熱化療可明顯增強(qiáng)阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對(duì)臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進(jìn)一步研究。

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綜上所述，加熱化療可明顯增強(qiáng)阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對(duì)臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進(jìn)一步研究。

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