右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵

王雅潔 （安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 合肥 230601）

芮廣虎 （揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇 泰州 225321）

右旋糖酐酶 （Dextranase，EC 3.2.1.11）是專一性地裂解右旋糖酐 （Dextran）分子中的α-1，6葡萄糖苷鍵的水解酶。在利用甘蔗生產(chǎn)蔗糖的過程中，由于甘蔗和糖汁存放使得微生物發(fā)酵產(chǎn)生大分子多糖右旋糖酐，生成的多糖所帶來的一些問題可以通過右旋糖酐酶解決[1]。除此之外，右旋糖酐酶在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)都有比較重要的用途?？谇恢屑?xì)菌合成的細(xì)菌多糖即右旋糖酐是牙菌斑的主要成分，所以細(xì)菌多糖是一個重要的致齲因子，而右旋糖酐酶的研究對于齲齒的防治、齲齒疫苗的開發(fā)是有重要意義的[2]；在右旋糖酐作為藥物載體增強藥物的化學(xué)穩(wěn)定性、生物利用度等作用的研究中，右旋糖酐酶的加入可用于研究該載體的釋放能力[3]；用右旋糖酐酶處理大分子右旋糖酐可以得到符合藥用要求的右旋糖酐，或利用其他酶聯(lián)用合成有特色功能的低聚糖[4]。

右旋糖酐酶是一種誘導(dǎo)酶，最常見的底物是右旋糖酐。國內(nèi)外已有報道，從霉菌、擬青霉、酵母、鏈球菌、環(huán)狀芽孢桿菌中分離到不同性能的右旋糖酐酶[5－8]。本研究從土壤中得到1株高活性右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌株，經(jīng)鑒定為擬青霉屬 （Paecilomyces），并對該菌產(chǎn)右旋糖酐酶發(fā)酵條件進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣來源：采自安徽安慶大別山區(qū)的土壤樣品。

主要試劑：Dextran T2000購自Pharmacia；右旋糖酐-70kDa購自許昌雙馬萬通制藥；其他為生化試劑、分析純試劑。

馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基 （PDA）；查氏培養(yǎng)基 （CA）；查氏酵母膏培養(yǎng)基 （CYA）。

篩選培養(yǎng)基：NaNO33g／L、K2HPO41g／L、KCl 0.5g／L、MgSO40.5g／L、FeSO40.01g／L、右旋糖酐-70kDa 10g／L、瓊脂20g／L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：右旋糖酐-70kDa 10g／L、蛋白胨5g／L、K2HPO44g／L、KCl 0.2g／L、MgSO40.2g／L、FeSO40.01g／L，pH6～7。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-90082電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）；KYC-100B空氣恒溫?fù)u床 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品）；SP-752紫外－可見分光光度計 （上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品）；BDS生物顯微鏡 （重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品）。

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐酶酶產(chǎn)生菌的篩選

取土壤樣品，用無菌水進行梯度稀釋，涂布到CA培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)7d后，將菌轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上，28℃繼續(xù)倒置培養(yǎng)7d。挑選能夠生長的菌株接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，利用打孔法檢測其對Dextran T2000的降解情況，篩選能產(chǎn)生較大透明圈的菌株[10]，CA斜面保藏。

1.3.2 右旋糖酐酶活力測定

按照文獻 [11]的方法測定，在40℃0.2mol／L的醋酸緩沖液 （pH5.0）中，采用3，5-二硝基水楊酸試劑法 （DNS法）測定葡萄糖的量[12]，以每分鐘生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活單位 （U）。

1.3.3 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：采用三點法觀察菌株在PDA、CYA和CA3種培養(yǎng)基上的生長情況。接種后28℃進行倒置培養(yǎng)，肉眼觀察菌落特征，插片法進行顯微觀察，依據(jù)參考文獻 [13～15]鑒定菌株的種屬。

分子生物學(xué)鑒定：提取真菌基因組DNA，委托上海生工生物工程有限公司進行ITS rDNA測序后，將獲得的目的DNA片段序列輸入GenBank，通過在線Blast程序進行比較分析，采用MEGA 4.1軟件的鄰接法 （Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 右旋糖酐酶發(fā)酵條件考察

250ml三角瓶裝基礎(chǔ)培養(yǎng)液50ml，接種后30℃120r／min振蕩培養(yǎng)所需時間后，發(fā)酵液10000r／min離心15min，上清液測定還原糖和酶活。采用單因素試驗考察碳源、氮源、起始pH、發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

對土壤樣品進行篩選后，得到的1株真菌DN01能夠降解右旋糖酐，經(jīng)28℃120r／min振蕩培養(yǎng)7d后發(fā)酵液上清酶的活力達(dá)到16U／ml。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)特征：菌落在PDA培養(yǎng)基上生長10d后直徑36～40mm，平展，質(zhì)地稀疏粉末狀呈紫色，表面中心具黃色細(xì)顆粒，背面黃色 （圖1A）；菌落在CYA培養(yǎng)基上生長10d后直徑38～40mm，平展，質(zhì)地稀疏粉末狀呈淡紫色，具明顯同心輪紋和放射狀紋，褶皺，背面白色微黃 （圖1B）；菌落在CA培養(yǎng)基上生長10d后直徑30～33mm，微凸，質(zhì)地疏松絨毛狀呈淡紫色，邊緣白色，背面白色 （圖1C）。菌絲和分生孢子特征：菌絲透明有隔、光滑，分生孢子呈橢圓形，透明光滑，排列成長鏈 （圖2）。從菌落、菌絲和孢子結(jié)構(gòu)特征看，初步判斷菌株DN01與擬青霉 （Paecilomyces）一致。

圖1 菌株DN01菌落形態(tài)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS rDNA特異引物得到551bp的目的DNA片段，將該序列提交到GenBank上，獲得GenBank登錄號為JN007854。通過Blast將該序列與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比對，結(jié)果顯示菌株DN01與3株擬青霉 （Paecilomyces）同源性高達(dá)99%。利用 MEGA 4.1軟件，鄰接法 （Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3。結(jié)合菌株形態(tài)特征及ITS序列分析結(jié)果，確定菌株DN01屬于半知菌類叢梗孢目叢梗孢科擬青霉屬（Paecilomyces）。

圖2 菌株DN01產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)

圖3 菌株DN01的基于ITS rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 右旋糖酐酶發(fā)酵

將菌種DN01接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28℃120r／min振蕩培養(yǎng)，每天取樣測定上清液的酶活和還原糖濃度，結(jié)果見圖4。在發(fā)酵過程中，還原糖的濃度緩慢上升。發(fā)酵前期，酶活增長緩慢，發(fā)酵的第5天酶活有明顯上升，發(fā)酵的第8天達(dá)到峰值，最大酶活為19.34U／ml。分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源右旋糖酐，以牛肉膏、酵母浸膏、硫酸銨、尿素代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ，接入同量的菌種，在30℃120r／min振蕩培養(yǎng)8d后，取上清液測酶活，考察碳源、氮源和起始pH對菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5～圖7。向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入同量的菌種，分別在不同溫度120r／min振蕩培養(yǎng)8d后，取上清液測酶活，考察發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖8。由結(jié)果可見，碳源種類對右旋糖酐酶生產(chǎn)有較大影響，以葡萄糖和蔗糖為碳源時，發(fā)酵液上清中檢測不到右旋糖酐酶活，以果糖、可溶性淀粉和乳糖為碳源時，發(fā)酵液上清中只能檢測到非常低的活力，右旋糖酐是菌種產(chǎn)右旋糖酐酶的最適誘導(dǎo)物。氮源種類對右旋糖酐酶的影響不大，選用的有機氮源和無機氮源都能夠得到到較大的右旋糖酐酶活力，其中以硫酸銨為氮源時得到的酶活力最大。發(fā)酵液的起始pH為4.0～5.0得到的酶活較大，當(dāng)起始pH高于8.0或低于4.0后發(fā)酵產(chǎn)酶活力明顯下降。隨著發(fā)酵溫度的上升，該菌株的產(chǎn)酶能力先升高后降低，發(fā)酵的最適溫度為30℃ 。

圖4 菌株DN01的產(chǎn)酶曲線

圖5 碳源對菌株DN01產(chǎn)酶的影響

圖6 氮源對菌株DN01產(chǎn)酶的影響

圖7 起始pH對菌株DN01產(chǎn)酶的影響

圖8 溫度對菌株DN01產(chǎn)酶的影響

3 討論

本研究從土壤中篩選到1株右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌DN01，經(jīng)鑒定為擬青霉 （Paecilomyces），為該酶的生產(chǎn)提供了新的來源。能產(chǎn)生右旋糖酐酶的菌很多，但是最有價值的酶生產(chǎn)菌是青霉和擬青霉。國內(nèi)較早報道右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌有曲霉 （Aspergillus）、淡紫擬青霉 （Paecilomyces lilacinus）[5，16]，近期的有繩狀青霉 （Penicillium funiculosum）[17]、黃綠青霉 （Penicillium citreoviridin）[20]和棘孢青霉（Penicillium aculeatum）[10]。國內(nèi)外報道的右旋糖酐酶的生產(chǎn)菌中屬于擬青霉屬的以淡紫擬青霉為主[16，19]，本研究篩選得到的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌DN01屬于擬青霉 （Paecilomyces），該菌未見報道，且該菌比國內(nèi)已報道的擬青霉產(chǎn)酶活力高。該菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的最適碳源為右旋糖酐，最適氮源為硫酸銨，起始pH 4.0～5.0，最適產(chǎn)酶溫度為30℃ 。該菌能夠利用無機氮源硫酸銨和尿素產(chǎn)生較高活力的右旋糖酐酶，與以前的報道[16－17]不同，有利于降低發(fā)酵成本及工業(yè)化生產(chǎn)。

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