豬腎細(xì)胞脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建與表征

陳文杰，崔海信，趙翔，崔金輝，王琰，孫長(zhǎng)嬌

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豬腎細(xì)胞脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建與表征

陳文杰，崔海信，趙翔，崔金輝，王琰，孫長(zhǎng)嬌

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所納米農(nóng)業(yè)研究中心，北京 100081

陳文杰, 崔海信, 趙翔, 等. 豬腎細(xì)胞脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建與表征. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 972?981.Chen WJ, Cui HX, Zhao X, et al.Construction and characterization of liposomal magnetofection system in pig kidney cells. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 972?981.

磁性納米基因載體是一種非病毒基因載體，經(jīng)過(guò)功能性基團(tuán)修飾后能夠連接陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑構(gòu)建細(xì)胞轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。本文將磁轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，形成了一種新型動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，即稱脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染(Liposomal magnetofection, LMF)。這將為體細(xì)胞克隆培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系。為構(gòu)建脂質(zhì)磁性納米基因載體復(fù)合物系統(tǒng)，本研究利用一種磁性納米基因載體通過(guò)分子自組裝與脂質(zhì)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑結(jié)合，用于攜帶外源基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物體細(xì)胞。通過(guò)原子力顯微鏡 (AFM) 觀測(cè)、ζ電位-粒度等分析表征手段，研究磁性納米基因載體的形貌、粒徑分布、負(fù)載及濃縮DNA的方式。結(jié)果表明，通過(guò)豬腎 (PK) 細(xì)胞的LMF實(shí)驗(yàn)，與脂質(zhì)體 (Lipofectamine2000) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染比較，具有較高的轉(zhuǎn)染率，更重要的是克服了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染瞬時(shí)表達(dá)的缺陷。MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果也顯示該方法具有較低的細(xì)胞毒性。因此LMF是一種切實(shí)可行的高效低毒性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。

脂質(zhì)磁性納米基因載體，磁轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染

應(yīng)用磁性納米粒子與脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì)聚合物通過(guò)分子自組裝、偶聯(lián)聚合等物理化學(xué)作用過(guò)程，構(gòu)建磁性脂質(zhì)體復(fù)合物，在磁場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下，有利于基因載體復(fù)合物吸附到細(xì)胞膜上，通過(guò)內(nèi)吞作用增加基因被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的概率，并進(jìn)入細(xì)胞核整合到基因組上、獲得穩(wěn)定表達(dá)，這個(gè)過(guò)程被稱為脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染(Liposomal magnetofection, LMF)。

磁轉(zhuǎn)染 (Magnetofection) 是指通過(guò)磁場(chǎng)作用將磁性納米載體運(yùn)轉(zhuǎn)的基因輸入和轉(zhuǎn)化的過(guò)程。Chan于1996年發(fā)表的專利文獻(xiàn)首次報(bào)道了基因的磁靶向傳輸，此項(xiàng)技術(shù)首先在分子治療領(lǐng)域得到應(yīng)用。Scherer等創(chuàng)造使用了磁轉(zhuǎn)染這一術(shù)語(yǔ)，并開始給了其明確的定義，從此磁轉(zhuǎn)染一詞被廣泛使用。此后，磁轉(zhuǎn)染在應(yīng)用于體內(nèi)外核酸轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究日益增多，包括用于體內(nèi)外反義寡核苷酸的輸送，轉(zhuǎn)化初生內(nèi)皮細(xì)胞等。

由含有磁性或可以被磁化的金屬或金屬氧化物等材料制備而成的納米粒子，具有磁響應(yīng)特性，可通過(guò)共價(jià)結(jié)合、表面改性等化學(xué)反應(yīng)賦予其表面多種功能基團(tuán)，以物理吸附、靜電作用、化學(xué)交聯(lián)等方式偶聯(lián)DNA等遺傳物質(zhì)，在外加磁場(chǎng)作用下進(jìn)行移動(dòng)和運(yùn)轉(zhuǎn)。氧化鐵包括三氧化二鐵(γ-FeO)和四氧化三鐵(FeO)，由于具有順磁性，在外加磁場(chǎng)下可產(chǎn)生磁性，因此可實(shí)現(xiàn)靶向驅(qū)動(dòng)性。為了改善其生物相容性以及富集核酸分子的能力，在FeO表面修飾殼聚糖、多聚賴氨酸、PEI (聚乙烯亞胺)、PEG (聚乙二醇)等，Petri-Fink等 將PEG、PEI、殼聚糖一起用于修飾納米氧化鐵顆粒，制備安全性較高的磁性納米基因載 體，一種修飾有殼聚糖 (Chitosan, CP) 和PEI的超順磁性氧化鐵納米顆粒 (Super paramagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONP)：CP-PEI-SPIONP，具高轉(zhuǎn)染效率和非常低的細(xì)胞毒性，由轉(zhuǎn)染小鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到50%，且細(xì)胞的生存率近100%。磁場(chǎng)介導(dǎo)條件下SPIONP磁轉(zhuǎn)染技術(shù)用于動(dòng)物或人體細(xì)胞的基因傳輸與轉(zhuǎn)化已經(jīng)有了很多研究。

脂質(zhì)體 (Liposome) 特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)體 (Cationic liposome) 作為一種基因轉(zhuǎn)運(yùn)工具得到了廣泛的應(yīng)用，與其他非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)一樣，它具有制備簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染效率高、無(wú)感染危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。但陽(yáng)離子脂質(zhì)體存在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、靶向性不高等缺點(diǎn)。為了彌補(bǔ)這些缺陷，有必要改善脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)或與先進(jìn)的靶向傳輸技術(shù)聯(lián)用，發(fā)展出新型的靶向性與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體。而磁轉(zhuǎn)染具有靶向性以及轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，磁性納米基因載體能夠克服脂質(zhì)體基因載體存在的缺陷。

本研究使用一種能夠與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合的順磁性納米顆粒，從而彌補(bǔ)陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為基因載體存在的不足。兩者結(jié)合形成的納米基因載體復(fù)合物，綜合了各自作為基因載體的優(yōu)勢(shì)，將改善外源基因的傳輸效率、轉(zhuǎn)化效果以及目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)獲得體細(xì)胞克隆培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞供體材料具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

pEGFP-N1大腸桿菌DH5α、PK細(xì)胞均由本室保存。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Fisher公司。無(wú)鈣鎂PBS溶液、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)DMSO購(gòu)自Gibco公司。卡那霉素、鏈霉素、青霉素、G418、MTT購(gòu)自Sigma公司。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。表面未修飾的云母片購(gòu)自中鏡科儀公司。磁性納米顆粒combiMAG100購(gòu)自德國(guó)Chemicell公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。DAPI細(xì)胞核染色液購(gòu)自碧云天生物公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

紫外可見分光光度計(jì) (UNICO UV-2100，上海)；酶標(biāo)儀 (Molecular Device SpectraMax 190，美國(guó))；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (上海求精生化試劑儀器有限公司，上海)；倒置熒光顯微鏡 (Olympus Ⅸ70，日本)；原子力顯微鏡 (Bruker Multimode Ⅷ，美國(guó))；激光粒度分析儀 (Malvern Zetasizer Nano ZS，英國(guó))。

1.2 PK細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5％ CO、一定濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)PK細(xì)胞，每48 h更換一次培養(yǎng)基，72 h后傳代培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒的制備

在超凈工作臺(tái)中挑取分散良好含pEGFP-N1質(zhì)粒的單菌落，接種于含30 μg/μL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)至菌體形成絮狀。用Tiangen公司無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的純度和濃度，取/≈1.8的質(zhì)粒置于–20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 納米基因載體及其復(fù)合物的表征

1.4.1 AFM觀測(cè)

稀釋pEGFP-N1質(zhì)粒至1.5 ng/μL備用，稀釋combiMAG至10 ng/μL，稀釋均使用超純水作為溶劑，振蕩混勻1 min。分別吸取稀釋后的質(zhì)粒DNA、combiMAG各5 μL，各加5 μL乙醇 (50%)，吹打混勻，靜置10 min。兩兩混勻后，渦旋振蕩1 min，37 ℃溫育30 min，制成combiMAG/DNA基因載體復(fù)合物。分別吸取稀釋后的質(zhì)粒DNA、combiMAG和制備好的combiMAG/DNA基因載體復(fù)合物各10 μL，均勻滴加到新解理的云母片表面，置于干凈培養(yǎng)皿中自然干燥。

AFM觀測(cè)：Multimode 型掃描探針顯微鏡，ScanAsyst模式，諧振頻率為0.977 Hz。

1.4.2 粒度分布及ζ電位分析

將combiMAG和脂質(zhì)體溶液用超純水稀釋至1 ng/μL，以此稀釋濃度按質(zhì)量比2∶2∶1制備的combiMAG/liposome/DNA復(fù)合物，各取稀釋樣品1.2 mL置入樣品皿中，用激光粒度分析儀測(cè)試粒徑分布及ζ電位。

1.4.3 脂質(zhì)磁性納米基因載體對(duì)DNA的凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)

取combiMAG與質(zhì)粒DNA (pEGFP-N1) 按照combiMAG/DNA為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1，combiMAG/liposome/DNA為1∶1∶1、2∶1∶1、2∶2∶1質(zhì)量比例振蕩混勻，37 ℃溫育30 min，連接制備復(fù)合物，取各個(gè)比例的連接復(fù)合物樣品5 μL，使用TE緩沖液稀釋至 1∶1 000的SYBR Green I染色液預(yù)染10 min，并上樣于1%瓊脂糖凝膠，90 V電壓條件下電泳40 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。

1.5 脂質(zhì)磁性納米基因載體復(fù)合物介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)基因

以含綠色熒光蛋白GFP基因的pEGFP-N1質(zhì)粒為外源DNA，通過(guò)制備脂質(zhì)磁性納米基因載體復(fù)合物，轉(zhuǎn)化PK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

1)吸取脂質(zhì)體2 μL，DMEM溶液稀釋至50 μL，吸取pEGFP-N1質(zhì)粒1 μg，用DMEM稀釋后與脂質(zhì)體按照質(zhì)量比為1∶2充分混勻，37 ℃溫育5 min后，加入含2 μg的combiMAG的DMEM溶液，振蕩混勻，37 ℃溫育30 min用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)照轉(zhuǎn)染組，質(zhì)量比脂質(zhì)體/DNA為2∶1。

2) 轉(zhuǎn)化前1天以每孔約1×10個(gè)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO培養(yǎng)至 細(xì)胞增殖到匯合率為70%左右，棄除舊培養(yǎng)液，PBS漂洗3–4次，加入上述配置好的基因載體復(fù)合物，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，補(bǔ)足DMEM 至500 μL。

3)將基因載體復(fù)合物加入到培養(yǎng)板各孔后，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于0.3 T的磁場(chǎng)下驅(qū)動(dòng)，放入37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。

4)磁場(chǎng)條件下孵育轉(zhuǎn)化3 h后，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、36、48、60、72 h后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，每48 h換液一次，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算其轉(zhuǎn)化效率。在轉(zhuǎn)染后72 h時(shí)加入抗生素G418 (400 μg/mL)，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后抗性篩選情況。

1.6 納米基因載體復(fù)合物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

0.25％胰酶消化培養(yǎng)的單層細(xì)胞，含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將其吹打制成細(xì)胞懸液，以每孔約1×10個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，加入200 μL培養(yǎng)基。在37 ℃、5％ CO條件下培養(yǎng)24 h后，按照1.5制備基因載體復(fù)合物的方法，載體和DNA的用量均為轉(zhuǎn)染用量的1/10，質(zhì)量比為combiMAG/DNA，1∶1，2∶1，5∶1；liposome/DNA，1∶1，2∶1；combiMAG/ liposome/DNA，1∶1∶1，2∶2∶1。在每孔內(nèi)分別加入，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為等體積的含血清培養(yǎng)基。加入基因載體復(fù)合物后，置于磁場(chǎng)下驅(qū)動(dòng)，37 ℃、5％ CO條件下溫育3 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)3 h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm吸收值，只加培養(yǎng)液的空白細(xì)胞設(shè)為對(duì)照調(diào)孔，以加入等體積的培養(yǎng)基、MTT、DMSO設(shè)為調(diào)零孔。細(xì)胞存活率 (Cell viability) =(樣品)/(對(duì)照)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒與納米基因載體復(fù)合物的表征

2.1.1 原子力顯微鏡觀測(cè)

質(zhì)粒DNA顯示出各種的形態(tài)，有環(huán)狀，有無(wú)規(guī)則的卷曲狀，還有堆積在一起形成的團(tuán)狀，如圖1A和1B所示。磁顆粒combiMAG粒徑分散較為平均，粒徑大小在80 nm左右，為表面光滑的球形結(jié)構(gòu)，分散性良好 (圖1C和1D)。DNA在連接combiMAG之后，被壓縮富集，吸附在combiMAG的周圍，可以看到每個(gè)磁顆?？梢赃B接多個(gè)DNA分子 (圖1E和1F)。

圖1 質(zhì)粒DNA、磁性納米顆粒combiMAG、combiMAG/DNA復(fù)合物的原子力顯微鏡圖像

2.1.2 粒徑分布與ζ電位測(cè)定

ζ電位反應(yīng)納米顆粒表面所帶電荷，其絕對(duì)值越大，顆粒之間的排斥力越大，則分散體系越穩(wěn)定，絕對(duì)值越趨于零，容易發(fā)生凝聚現(xiàn)象。ζ電位是體現(xiàn)納米顆粒性能的一個(gè)重要參數(shù)，是決定納米顆粒穩(wěn)定性或在分散體中聚集性的重要因素。同時(shí)正的ζ電位更有利于富集更多帶負(fù)電的核酸分子形成納米基因載體復(fù)合物趨向帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，增加基因輸送入細(xì)胞內(nèi)的概率，對(duì)轉(zhuǎn)染效率的提高具有重要意義。應(yīng)用激光粒度-zeta電位分析儀測(cè)得為納米粒子的疏水粒徑，combiMAG的平均粒徑為 (161.7±1.2) nm (圖2A，2C)。如圖2C所示，combiMAG/DNA、combiMAG/lipo/DNA的平均粒徑依次增加，分別為 (170.5±0.8) nm、 (189.9±2.3) nm，說(shuō)明基因載體復(fù)合物已經(jīng)初步形成。如圖2D所示，combiMAG的ζ電位為 (13.8±0.7) mV (圖2B，2D)，脂質(zhì)體liposome、liposome/DNA、combiMAG/lipo/DNA/的ζ電位依次為(49.4±1.3) mV、(24.3±1.6) mV、 (33.9±1.5) mV。由此可以看出，負(fù)載基因的納米基因載體復(fù)合物帶較強(qiáng)的正電性，有利于基因載體復(fù)合物通過(guò)靜電作用吸附到細(xì)胞膜表面通過(guò)細(xì)胞吞噬作用被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。

圖2 基因載體與載體DNA復(fù)合物的粒徑分布與ζ電位分析

2.1.3 脂質(zhì)磁性納米基因載體對(duì)DNA的凝膠阻滯電泳分析

脂質(zhì)磁性納米基因載體對(duì)DNA的凝膠阻滯電泳圖結(jié)果見圖3，泳道1–5為對(duì)DNA的結(jié)合能力分析，combiMAG/DNA質(zhì)量比依次為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1，泳道6為單獨(dú)的combiMAG。可見逸出點(diǎn)樣孔的DNA條帶亮度越來(lái)越低，呈梯度減弱，combiMAG結(jié)合能力與其質(zhì)量成正比。泳道7–9為脂質(zhì)磁性載體復(fù)合物對(duì)DNA的富集與結(jié)合能力分析，可見大部分DNA分子被結(jié)合形成基因載體復(fù)合物滯留在點(diǎn)樣孔中，脂質(zhì)磁性載體結(jié)合DNA能力較強(qiáng)。脂質(zhì)磁性載體結(jié)合DNA后，能夠減少細(xì)胞內(nèi)核酸酶對(duì)外源基因的水解，起到保護(hù)作用。

2.2 脂質(zhì)磁轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞

圖4為報(bào)告基因綠色熒光蛋白在24 h (A，C，E) 和72 h (B，D，F(xiàn)) 時(shí)表達(dá)情況的顯微鏡圖像，A和B為脂質(zhì)體對(duì)照組，E和F為 combiMAG轉(zhuǎn)染組，C和D為L(zhǎng)MF組。隨著轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)表達(dá)減弱的現(xiàn)象，LMF組則顯現(xiàn)出比較穩(wěn)定的表達(dá)，并有增強(qiáng)的趨勢(shì)，細(xì)胞增殖也是一方面原因。轉(zhuǎn)染后24 h開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的記錄，變化趨勢(shì)如圖5所示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組從36 h開始出現(xiàn)表達(dá)減弱的趨勢(shì)，體現(xiàn)其瞬時(shí)表達(dá)的特征；LMF組，綠色熒光在48 h表達(dá)最強(qiáng)，且穩(wěn)定表達(dá)，比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與磁轉(zhuǎn)染效果都好。

72 h后加入G418，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行初步篩選鑒定，在之后24 h起LMF組便開始獲得較多成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞，而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的缺陷，未穩(wěn)定表達(dá)GFP的大部分PK細(xì)胞被G418殺死，陽(yáng)性細(xì)胞的得率很低。

圖3 脂質(zhì)磁性納米基因載體對(duì)DNA的凝膠阻滯電泳分析

圖4 轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)效果圖

圖5 轉(zhuǎn)染熒光表達(dá)效率趨勢(shì)圖

2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

如圖6所示，橫坐標(biāo)表示每個(gè)孔的加入量 (200 μL培養(yǎng)基)，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞的存活率。磁性納米載體combiMAG的細(xì)胞毒性隨著加入量的增加而增大，但細(xì)胞存活率都在0.9以上，比相同濃度下的脂質(zhì)體、陽(yáng)離子基因載體PEI、常用轉(zhuǎn)染劑polyfect都要低，顯示出較好的生物相容性。值得注意的是，combiMAG與脂質(zhì)體形成的基因載體復(fù)合物的細(xì)胞毒性要比單獨(dú)的相同濃度的脂質(zhì)體細(xì)胞毒性還低，有可能是兩者之間的偶聯(lián)聚合作用降低了載體復(fù)合物的細(xì)胞毒性(經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)間具有顯著差異性，＜0.01)。

圖6 各轉(zhuǎn)染劑對(duì)細(xì)胞的毒性

3 討論

理想的應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的非病毒基因載體應(yīng)具有較低的細(xì)胞毒性，較強(qiáng)的核酸結(jié)合保護(hù)能力以及較高的轉(zhuǎn)染效率等特性，磁性納米基因載體具有納米載體材料小尺寸、比表面積大、表面易修飾性等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)功能化修飾，富集DNA能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)在磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下具有磁靶向性。本實(shí)驗(yàn)室在以往的工作中已經(jīng)開展了動(dòng)植物細(xì)胞磁轉(zhuǎn)染技術(shù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行了聚乙烯亞胺、氨基硅烷和殼聚糖修飾的3種磁性納米顆粒作為基因工程載體的研究，并驗(yàn)證了磁性納米載體作為293T細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染載體的可行性與優(yōu)越性，本研究在以往工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了拓展：將磁性納米基因載體與脂質(zhì)體結(jié)合，形成一種新型的LMF方法用于細(xì)胞轉(zhuǎn)基因，兼具磁轉(zhuǎn)染與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)點(diǎn)，不僅克服了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)性缺陷，還體現(xiàn)出低細(xì)胞毒性、高轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，從納米尺度使用AFM直觀地觀測(cè)到單個(gè)納米基因載體負(fù)載連接質(zhì)粒DNA的作用方式；此外，對(duì)于轉(zhuǎn)染同一類型的豬體細(xì)胞，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不到24 h即觀測(cè)到高效率的基因表達(dá)，比單純的磁轉(zhuǎn)染表達(dá)更為迅速，還呈現(xiàn)高出多倍的表達(dá)效率和持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)效果。這對(duì)于優(yōu)化細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)程具有重要的意義。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因載體往往運(yùn)載單個(gè)目的基因片段，主要是由于運(yùn)輸載體和表達(dá)載體的基因裝載量有限，不能夠高效地實(shí)現(xiàn)多基因協(xié)同并轉(zhuǎn)。而LMF方法由于具備納米材料載體的優(yōu)良特性，表面可修飾特異性基團(tuán)，如含有核定位序列的魚精蛋 白，有望實(shí)現(xiàn)基因高效轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核的幾率，增加轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)還可能裝載大片段基因以及多個(gè)外源基因共轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)多基因并轉(zhuǎn)，Park等使用二次LMF的方法，將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笈咛コ衫w維細(xì)胞中，快速高效生成了無(wú)病毒的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells, IPSC)，細(xì)胞重編程效率高達(dá)0.032%–0.04%，這比一般的磁轉(zhuǎn)染方法誘導(dǎo)生成IPSC的效率 (0.001%–0.003%) 要高得多，而一般的非病毒載體誘導(dǎo)IPSC的效率只有 0.000 1%–0.001 2%。同時(shí)，使用LMF方法轉(zhuǎn)染動(dòng)物體細(xì)胞或生殖細(xì)胞，對(duì)發(fā)展核移植技術(shù)、培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種、改善動(dòng)物優(yōu)良性狀具有重要意義。

磁場(chǎng)條件介導(dǎo)的 (脂質(zhì)) 磁轉(zhuǎn)染過(guò)程中磁性納米基因載體傳輸 (Delivery) 基因進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)機(jī)制是磁轉(zhuǎn)染研究的難點(diǎn)，包括入胞后其所負(fù)載DNA的釋放機(jī)制，是否進(jìn)入細(xì)胞核，以及完成基因轉(zhuǎn)運(yùn)后是否排出 (Release) 至胞外等過(guò)程機(jī)制問(wèn)題，均有待于進(jìn)一步研究。

REFERENCES

[1] Mykhaylyk O, Sánchez-Antequera Y, Vlaskou D, et al. Liposomal Magnetofection. New York: Humana Press, 2010: 487–525.

[2] Mykhaylyk O, Sánchez-Antequera Y, Vlaskou D, et al. Generation of magnetic nonviral gene transfer agents and magnetofection. Nat Protoc, 2007, 2(10): 2391–2411.

[3] Chan DCF. Magneto-biolistic methods: US, 5753477. 1998-05-19.

[4] Mah C, Zolotukhin I, Fraites TJ, et al. Microsphere mediated delivery of recombinant AAV vectorsand. Mol Ther, 2000, 1: S239.

[5] Scherer F, Anton M, Schillinger U, et al. Magnetofection: enhancement and localization of gene delivery with magnetic particles under the influence of a magnetic field. J Gene Med, 2000, 2: S24.

[6] Kr?tz F, De Wit C, Sohn HY, et al. Magnetofection-a highly efficient tool for antisense oligonucleotide deliveryand. Mol Ther, 2003, 7(5 Pt 1): 700–710.

[7] Kr?tz F, Sohn HY, Gloe T, et al. Magnetofection potentiates gene delivery to cultured endothelial cells. J Vas Res, 2003, 40(5): 425–434.

[8] Yoon TJ, Kim JS, Kim BG, et al. Multifunctional nanoparticles possessing a “magnetic motor effect” for drug or gene delivery. Angew Chem Int Edit, 2005, 117(7): 1092–1095.

[9] Xiang JJ, Tang JQ, Zhu SG, et al. IONP‐PLL: a novel non‐viral vector for efficient gene delivery. J Gene Med, 2003, 5(9): 803–817.

[10] Steitz B, Hofmann H, Kamau SW, et al. Characterization of PEI-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfection: size distribution, colloidal properties and DNA interaction. J Magn Magn Mater, 2007, 311(1): 300–305.

[11] Wang H, Zhang S, Liao Z, et al. PEGlated magnetic polymeric liposome anchored with TAT for delivery of drugs across the blood-spinal cord barrier. Biomaterials, 2010, 31(25): 6589–6596.

[12] Kievit FM, Veiseh O, Bhattarai N, et al. PEI-PEG-chitosan-copolymer-coated iron oxide nanoparticles for safe gene delivery: synthesis, complexation, and transfection. Adv Funct Mater, 2009, 19(14): 2244–2251.

[13] Petri-Fink A, Steitz B, Finka A, et al. Effect of cell media on polymer coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs): colloidal stability, cytotoxicity, and cellular uptake studies. Eur J Pharm Biopharm, 2008, 68(1): 129–137.

[14] Song HP, Yang JY, Lo SL, et al. Gene transfer using self-assembled ternary complexes of cationic magnetic nanoparticles, plasmid DNA and cell-penetrating Tat peptide. Biomaterials, 2010, 31(4): 769–778.

[15] Cheong SJ, Lee CM, Kim SL, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles-loaded chitosan-linoleic acid nanoparticles as an effective hepatocyte-targeted gene delivery system. Int J Pharmaceut, 2009, 372(1): 169–176.

[16] Kami D, Takeda S, Itakura Y, et al. Application of magnetic nanoparticles to gene delivery. Int J Mol Sci, 2011, 12(6): 3705–3722.

[17] Aronsohn AI, Hughes JA. Nuclear localization signal peptides enhance cationic liposome-mediated gene therapy. J Drug Target, 1998, 5(3): 163–169.

[18] Wang C, Ding C, Kong M, et al. Tumor-targeting magnetic lipoplex delivery of short hairpin RNA suppresses IGF-1R overexpression of lung adenocarcinoma A549 cellsand. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 410(3): 537–542.

[19] Zheng J, Li Z, Wu A, et al. AFM studies of DNA structures on mica in the presence of alkaline earth metal ions. Biophys Chem, 2003, 104(1): 37–43.

[20] Zhang Y, Yang M, Portney NG, et al. Interaction of nanoparticles with normal and cancer human breast epithelial cells. Biomed Microdev, 2008, 10(2): 321–328.

[21] Li Y. Method study on magnetic nanoparticles as gene engineering carriers in cell transformation[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2010(in Chinese).李瑤. 磁性納米基因工程載體細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

[22] Lu YM, Cui HX, Cui JH, et al. Study on magnetic nanoparticles as carriers for gene transfection. Biotech Bull, 2012, 8: 199–204(in Chinese).盧艷敏, 崔海信, 崔金輝, 等. 磁性納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)染載體的研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2012, 8: 199–204.

[23] Qi L, Wu L, Zheng S, et al. Cell-penetrating magnetic nanoparticles for highly efficient delivery and intracellular imaging of siRNA. Biomacromolecules, 2012, 13(9): 2723–2730.

[24] Park HY, Noh EH, Chung HM, et al. Efficient generation of virus-free iPS cells using liposomal magnetofection. PLoS ONE, 2012, 7(9): e45812.

[25] Lee CH, Kim JH, Lee HJ, et al. The generation of iPS cells using non-viral magnetic nanoparticlebased transfection. Biomaterials, 2011, 32(28): 6683–6691.

[26] Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, 322(5903): 949–953.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Construction and characterization of liposomal magnetofection system in pig kidney cells

Wenjie Chen, Haixin Cui, Xiang Zhao, Jinhui Cui, Yan Wang, and Changjiao Sun

Research Center for Nanoscale Science in Agriculture, Institute of Environment and Sustainable Development on Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing 100081, China

Magnetic nano gene vector is one of the non-viral gene vectors, modified by functional group to bind cationic transfect reagents. Coupling magnetofection with the universal lipofection we developed a novel somatic cell transfection method as the so-called liposomal magnetofection (LMF). This approach is potential to provide somatic cell cloning with stable genetic cell lines to cultivate transgenic animals. In order to construct such liposomal magnetic gene vectors complexes system, we used nano magnetic gene vector to combine with liposomal cationic transfect reagents by molecular self-assembly. This vectors system successfully carried exogenous gene and then transfected animal somatic cells. Here, we conducted atomic force microscopy (AFM), zeta potential-diameter analysis and other characterization experiments to investegate the size distribution and morphology of magnetic nanoparticles, the way of the vectors to load and concentrate DNA molecules. Our data reveal that, the LMF of Pig Kidney cells exhibited higher transfection efficiency comparing with the transfection mediated by the commercial lipofectamine2000. Moreover, LMF method overcomes the constraint of transient expression mediated by lipofection. Meanwhile, MTT assay showed low cytotoxicity of LMF. Hence, LMF is a feasible, low cytotoxic and effective method of cell transfection.

liposomal magnetic nano gene vector, magnetofection, liposomal magnetofection (LMF)

September 13, 2013; Accepted: December 13, 2013

Genetically Modified Organisms Breeding Major Projects (No. 2009ZX08010-006B), Basic Scientific Research Fund of National Nonprofit Institutes (No. BSRF 201108).

Haixin Cui. Tel/ Fax: +86-10-82105997; E-mail: haixincui@ieda.org.cn

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng) (No. 2009ZX08010-006B)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(No. BSRF 201108) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2013-12-19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131219.1535.001.html