miR373和miR542-5p調(diào)控腸道病毒71型在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的復(fù)制

楊倬1，田波2

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miR373和miR542-5p調(diào)控腸道病毒71型在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的復(fù)制

楊倬，田波

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，北京 100050 2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

楊倬, 田波. miR373和miR542-5p調(diào)控腸道病毒71型在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的復(fù)制. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 943?953.Yang Z, Tien P. miR373 and miR542-5p regulate the replication of Enterovirus 71 in rhabdomyosarcoma cells. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 943?953.

研究發(fā)現(xiàn)microRNAs (miRNAs) 可以參與調(diào)控病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)感染和復(fù)制的過程。為了揭示miRNAs是否參與腸道病毒71型 (Enterovirus 71, EV71) 的感染與復(fù)制，研究了miRNAs 對(duì)EV71病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響。構(gòu)建miRNAs靶基因篩選系統(tǒng)，在雙熒光素酶報(bào)告體系的pMIR載體插入病毒基因，如果插入的基因序列能被細(xì)胞內(nèi)的miRNAs靶向調(diào)控，報(bào)告基因的表達(dá)將發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶標(biāo)。隨后利用miRNAs在線分析軟件預(yù)測(cè)并驗(yàn)證可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。為了研究miRNAs分子對(duì)5′-UTR基因的調(diào)控作用是否可以體現(xiàn)在EV71病毒的復(fù)制過程中，在人橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma, RD)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNAs mimics，利用Western blotting和real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)EV71病毒的復(fù)制和表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR373和miR542-5p可以通過作用于EV71病毒5′-UTR基因從而抑制病毒在RD細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)miR373和miR542-5p可以調(diào)控EV71在宿主細(xì)胞中的復(fù)制過程。研究EV71病毒與宿主miRNAs的相互作用機(jī)制為進(jìn)一步闡明EV71病毒感染與復(fù)制機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

miRNAs，腸道病毒71型，人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，病毒復(fù)制

miRNAs是近幾年分子生物學(xué)研究方面的熱點(diǎn)，它是一類長(zhǎng)度大約為19?25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過抑制靶基因mRNA的翻譯過程或者降解靶基因的mRNA分子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控過程。miRNAs首先是由基因組轉(zhuǎn)錄出初始產(chǎn)物，稱為pri-miRNA，pri-miRNA 在Drosha核酸內(nèi)切酶的作用下剪切成長(zhǎng)度約為60?70個(gè)核苷酸，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNAs前體，稱為premiRNA。pre-miRNA 在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，被核酸內(nèi)切酶Dicer剪切成19?25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的雙鏈RNA，隨即雙鏈解旋，形成成熟的miRNAs。成熟的miRNAs與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合(RISC)，結(jié)合到有互補(bǔ)序列的mRNA 上，抑制該mRNA的翻譯或者使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。

研究表明，miRNAs不但可以參與調(diào)控細(xì)胞中如細(xì)胞增殖、凋亡、分化等一系列的生理過程，還可以參與調(diào)控病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程。2005年，Charles-Henri Lecellier 等報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，miR32可以通過與病毒mRNA結(jié)合有效地抑制Ⅰ型靈長(zhǎng)類泡沫病毒(PFV-I) 在細(xì)胞中的積累；2008年，Henke和Chang等同時(shí)報(bào)道在肝組織特異性表達(dá)的miR122能通過與丙型肝炎病毒(HCV) 基因組5￠非編碼區(qū)的相互作用，使病毒RNA在細(xì)胞中富集，誘導(dǎo)病毒基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)丙型肝炎病毒在肝癌細(xì)胞系(Huh-7細(xì)胞) 中的復(fù)制，在非肝細(xì)胞(如HEK-293 和HeLa) 中過表達(dá)miR122也同樣可以觀察到這種作用。

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD) 是由多種腸道病毒引起的，以嬰幼兒發(fā)病為主的常見傳染病。腸道病毒是引發(fā)食源性疾病的主要病因，主要經(jīng)食物、水和環(huán)境進(jìn)行傳播。腸道病毒71型 (Enterovirus 71) 屬于小RNA病毒科 (Picrornaviridae) 腸道病毒屬 (Enterovirus, EV) 是一類常見的經(jīng)呼吸道和消化道感染人體的病毒, 是手足口病的主要病原體。RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體EV71和CVA16等多種腸道病毒的復(fù)制，均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)miRNAs是否參與EV71病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，構(gòu)建了miRNAs靶基因篩選系統(tǒng)，利用雙熒光素酶報(bào)告體系來研究EV71病毒基因表達(dá)是否受到miRNAs的調(diào)控。根據(jù)報(bào)告基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)作用在EV71病毒的5￠-UTR基因上的miR373和miR542-5p可能會(huì)對(duì)EV71病毒的復(fù)制有影響。本文首次報(bào)道了miR373和miR542-5p對(duì)EV71病毒在RD細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的調(diào)控作用，為miRNAs參與調(diào)節(jié)EV71病毒復(fù)制的相關(guān)研究提供了有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒和細(xì)胞株

EV71 Hubei-09 (C4亞型，GenBank Accession No. GU434678) 株由武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Rhabdomyosarcoma, RD) 為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMIR和pRL-CMV熒光素酶報(bào)告載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 miRNAs的合成

miR373和miR542-5p mimics，miR-RiboTM mimics Negative control由廣州銳博生物有限公司進(jìn)行合成。

1.1.3 試劑和儀器

核酸限制性內(nèi)切酶Ⅰ、d Ⅲ，T4 DNA連接酶及Pyrobest高保真性DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。鼠源EV71單克隆抗體 (MAB979)購(gòu)自Millipore公司。-actin及辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中山金橋公司。RNA提取Trizol試劑購(gòu)自上海Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄、Real time PCR、雙熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega 公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 培養(yǎng)基和胎牛血清 (FBS) 購(gòu)自Gibco BRL公司。蛋白電泳儀、PCR儀及酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。Real time PCR 儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2 miRNAs靶基因篩選系統(tǒng)的建立

1.2.1 重組載體的構(gòu)建

用于miRNAs作用靶標(biāo)篩選的3′-UTR分析系統(tǒng)包含兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因載體，一個(gè)為pMIR載體，另一個(gè)為pRL-CMV載體。pMIR載體可以表達(dá)螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶的3′-UTR區(qū)含有多克隆位點(diǎn)插入目的基因。pRL-CMV載體能高效表達(dá)海腎熒光素酶，作為內(nèi)參。根據(jù)EV71 Hubei-09株的基因序列(GenBank Accession No. GU434678.1)，以EV71全長(zhǎng)cDNA為模板，克隆得到EV71的13個(gè)基因片段5′UTR、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3BC、3D1、3D2、3′UTR，以及5′-UTR的3個(gè)亞片段5′-UTR-1、2、3。然后將以上的基因片段插入pMIR載體3′-UTR區(qū)的多克隆位點(diǎn)中的Ⅰ/dⅢ限制性酶切位點(diǎn)處。構(gòu)建成重組載體pMIR-EV71-(5′UTR、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3BC、3D1、3D2、3′UTR、5′UTR-1、5′UTR-2、5′UTR-3)。實(shí)驗(yàn)中所用引物均由北京奧科生物公司合成，序列見表1。

表1 EV71病毒基因片段的PCR擴(kuò)增引物

1.2.2 miRNAs結(jié)合靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

ViTa數(shù)據(jù)庫包括了已知病毒的miRNAs以及相應(yīng)的由miRanda和TargetScan預(yù)測(cè)的宿主miRNAs靶基因。MicroInspector在線分析軟件可以預(yù)測(cè)特定miRNAs的作用靶基因，也可以預(yù)測(cè)在已知序列上具有潛在作用靶點(diǎn)的miRNAs。而rna22和RNA Hybrid在線分析軟件則主要針對(duì)兩條已知的RNA序列的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，通過二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)合自由能來評(píng)價(jià)。我們利用MicroInspector和ViTa預(yù)測(cè)病毒基因片段上潛在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs，用rna22和RNA Hybird驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.3 雙熒光素酶檢測(cè)

RD細(xì)胞接種于24孔板中，將構(gòu)建好的重組pMIR載體和pRL-CMV載體利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，轉(zhuǎn)染30 h后收集細(xì)胞，用PBS洗一遍細(xì)胞，稀釋5×裂解液，24孔板每孔加入100 μL，冰上放置10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清采用Promega公司的雙熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。如果構(gòu)建在pMIR載體上的病毒基因序列受到宿主細(xì)胞內(nèi)的miRNAs的調(diào)控，將影響載體上熒光素酶的表達(dá)，通常以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，用測(cè)定的螢火蟲熒光素酶的表達(dá)值比海腎熒光素酶的表達(dá)值，考察螢火蟲熒光素酶活性的變化。

1.3 Western blotting檢測(cè)

RD細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱，飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%?90%時(shí)，用2.5% 胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的RD細(xì)胞，用DMEM終止消化，4 ℃、500 r/min離心5 min，用DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2′10/mL的單細(xì)胞懸液，以1 mL/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，合成的miRNAs mimics及陰性對(duì)照miR-RiboTM mimics Negative control分別轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，6 h后接種10 μL的TCID為1′10的EV71病毒。48 h后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，12 000 r/min離心10 min 收集上清液，15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。10% 脫脂奶粉封閉過夜。孵育特異性抗體，鼠源EV71單克隆抗體濃度為1∶2 000，-actin抗體為1∶2 000，二抗為辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG濃度為1∶2 000，加ECL發(fā)光液，顯影。

1.4 Real-time PCR 檢測(cè)

取2.5%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的RD細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2′10/mL的單細(xì)胞懸液，以1 mL/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，合成的miRNAs mimics及陰性對(duì)照miR-RiboTM mimics Negative control分別轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，6 h后，每孔接種10 μL的TCID為1′10的EV71病毒，48 h后按照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，取RNA 150 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，設(shè)計(jì)EV71病毒和基因的引物，Real-time PCR引物由北京奧科生物公司合成 (表2)。按照Promega Real-Time PCR 試劑盒說明書進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增后按照2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)值，分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)包含兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因載體，pMIR載體可以表達(dá)螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶的3′-UTR區(qū)含有多克隆位點(diǎn)插入病毒基因。pRL-CMV載體能高效表達(dá)海腎熒光素酶，作為內(nèi)參。如圖1所示，將EV71的13個(gè)基因片段5′UTR、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3BC、3D1、3D2、3′UTR插入pMIR載體3′-UTR區(qū)的多克隆位點(diǎn)中的Ⅰ/d Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)處。構(gòu)建成重組載體pMIR-EV71-(5′UTR、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3BC、3D1、3D2、3′UTR)。將構(gòu)建好的重組雙熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞篩選miRNAs調(diào)控病毒基因的靶位點(diǎn)。

表2 Real-time PCR反應(yīng)中用于擴(kuò)增EV 71 vp1和β-actin的引物

圖1 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)構(gòu)建

2.2 EV71病毒的5′-UTR基因片段是宿主細(xì)胞miRNAs的作用靶點(diǎn)

將構(gòu)建的重組pMIR載體和pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)的RD細(xì)胞，30 h后進(jìn)行Luciferase雙熒光檢測(cè)。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為轉(zhuǎn)染pMIR空載體的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pMIR-5′UTR重組載體的細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性抑制最為顯著。由此推測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的下調(diào)可能是宿主miRNAs介導(dǎo)的抑制作用，病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶點(diǎn)。為了更加明確作用位點(diǎn)，將EV71病毒5′-UTR基因片段分為3個(gè)亞片段連接到pMIR載體中，構(gòu)建重組載體pMIR-EV71-(5′UTR-1、5′UTR-2、5′UTR-3)。圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pMIR-5′UTR-1重組載體的細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性最低。以上結(jié)果說明5′UTR-1基因片段很有可能是宿主miRNAs的潛在的作用靶點(diǎn)從而能夠抑制報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)。

2.3 靶向5′UTR-1基因片段的miRNAs的預(yù)測(cè)

為了確定宿主細(xì)胞miRNAs是否能夠功能性抑制pMIR-5′UTR-1重組載體的熒光素酶活性，我們利用MicroInspector和ViTa預(yù)測(cè)5′-UTR-1基因片段上潛在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs，用rna22和RNA雜交在線程序 (Hybrid online program) 驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，初步選定miR373和miR542-5p可能是潛在的能夠靶向EV71病毒基因5′-UTR-1的miRNAs，其序列及與5′-UTR-1基因片段的互補(bǔ)配對(duì)模式見表3。序列分析顯示miR373和miR542-5p5′端的種子序列與5′-UTR-1基因上的靶點(diǎn)序列完全匹配。

2.4 miR373和miR542-5p對(duì)pMIR-5′UTR-1載體熒光素酶活性的影響

將合成的miR373和miR542-5p mimics，miR-RiboTM mimics Negative control為陰性對(duì)照，分別同pMIR-5′UTR-1和pRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，30 h后進(jìn)行Luciferase雙熒光檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR373和miR542-5p能在一定程度上下調(diào)熒光素酶的活性 (圖4)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR373和miR542-5p能夠通過靶向EV71病毒基因5′-UTR-1發(fā)揮作用。

圖2 EV71病毒13個(gè)基因片段重組pMIR載體的相對(duì)熒光素酶活性比較

圖3 EV71病毒5′-UTR 3個(gè)亞基因片段重組pMIR載體的相對(duì)熒光素酶活性比較

表3 miR373和miR542-5p序列及與5′-UTR-1基因片段的互補(bǔ)配對(duì)模式

圖4 miR373和miR542-5p對(duì)pMIR-5′UTR-1載體熒光素酶活性的影響

2.5 miR373和miR542-5p調(diào)控EV71在RD細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)

為了驗(yàn)證miR373和miR542-5p靶向病毒5′-UTR-1的調(diào)控作用能否影響EV71病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，將合成的miR373和miR542-5p mimics，miR-RiboTM mimics Negative control為陰性對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染12孔板培養(yǎng)的RD細(xì)胞，感染病毒48 h后提取細(xì)胞蛋白，通過Western blotting檢測(cè)EV71病毒蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)比各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EV71病毒蛋白的表達(dá)量，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明與對(duì)照相比，miR373和miR542-5p能夠抑制EV71病毒蛋白在RD細(xì)胞中的表達(dá)。

2.6 miR373和miR542-5p調(diào)控EV71在RD細(xì)胞中病毒mRNA的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR373和miR542-5p能夠調(diào)控EV71病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，將合成的miR373、miR542-5p mimics和miR-RiboTM mimics Negative control為陰性對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染12孔板培養(yǎng)的RD細(xì)胞，感染病毒48 h后用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用Real-time PCR分析miR373和miR542-5p對(duì)EV71病毒mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR373和miR542-5p的細(xì)胞中EV71病毒mRNA表達(dá)分別下調(diào)了47.59%±4.89%和61.41%±2.69%，說明miR373和miR542-5p能夠促抑制EV71病毒mRNA在RD細(xì)胞中的表達(dá)。這一結(jié)果與Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 Western blotting檢測(cè)miR373和miR542-5p對(duì)EV71在RD細(xì)胞中病毒蛋白表達(dá)的影響

圖6 Real-time PCR檢測(cè)miR373和miR542-5p對(duì)EV71在RD細(xì)胞中病毒mRNA表達(dá)的影響

3 討論

病毒感染細(xì)胞后，與宿主細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜的相互作用，二者相互影響。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，促使宿主細(xì)胞發(fā)生有利于病毒自身復(fù)制增殖的改變，包括miRNAs表達(dá)水平的變化。如在Epstein-Barr病毒感染細(xì)胞后能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生miR155，miR155參與了Epstein-Barr病毒調(diào)控宿主基因表達(dá)的過程。而EB病毒的LMP1 蛋白通過NF-κB途徑能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中miR146a的表達(dá)，miR146a通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，在誘導(dǎo)和維持EB病毒的潛伏中起重要作用。病毒能影響細(xì)胞miRNAs的表達(dá)水平，而miRNAs也能對(duì)病毒蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，影響病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。在宿主細(xì)胞受到病毒感染后，免疫系統(tǒng)也會(huì)針對(duì)病毒產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)，其中某些就是通過miRNAs的作用來實(shí)現(xiàn)的。如HIV感染后，宿主細(xì)胞編碼的一系列靶向HIV蛋白的miRNAs能抑制病毒的復(fù)制，其中miR29a和miR29b可以靶向基因，miR149可以靶向基因，miR378可以靶向基因，而miR324-5p則可以靶向基因。哺乳動(dòng)物的miR32則能抑制Ⅰ型泡沫病毒(PFV-I) 在宿主細(xì)胞中的積累。

病毒對(duì)于宿主細(xì)胞這種利用miRNAs 分子抗病毒感染作用也有相應(yīng)的拮抗方式，如HCV 的核心蛋白能直接作用于miRNAs 成熟的關(guān)鍵核酸酶Dicer，而HIV-1病毒編碼的Tat蛋白也能與Dicer酶相互作用抑制其功能，這些蛋白起到了RNA沉默抑制劑的作用。另外Haasnoot等在Vero細(xì)胞中也檢測(cè)到NS1能抑制siRNA對(duì)Luciferase蛋白表達(dá)的下調(diào)，表現(xiàn)出RNA沉默抑制劑的作用。

另外大多病毒基因組編碼的miRNAs 不僅可以靶向自身蛋白，還可以調(diào)控宿主抗病毒通路，如人巨細(xì)胞病毒HCMV編碼的miRUL112-1能靶向病毒基因組的3′非編碼區(qū)，調(diào)控包括即早期蛋白IE72在內(nèi)的多個(gè)病毒蛋白的表達(dá)；而HIV-1則能通過編碼參與調(diào)控CD4、CD28、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子的miRNAs，來抑制宿主的抗病毒作用。一般認(rèn)為miRNAs是通過增強(qiáng)病毒蛋白表達(dá)、抑制宿主細(xì)胞抗病毒功能或抑制宿主細(xì)胞凋亡等幾個(gè)途徑來促進(jìn)病毒復(fù)制的。Jopling等的研究表明miR122通過與HCV基因組的5′非編碼區(qū)相互作用使病毒RNA 在細(xì)胞中富集，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制。Cui等對(duì)感染EV71病毒后的Hep2細(xì)胞進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)感染EV71病毒后miRNAs表達(dá)的變化，其中發(fā)現(xiàn)有64種miRNA的表達(dá)量增加超過了2倍，并通過基因本體(Gene ontology) 分析，發(fā)現(xiàn)這其中大部分基因參與EV71感染相關(guān)的神經(jīng)活動(dòng)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡。其首次驗(yàn)證了miRNA與EV71感染的關(guān)系，但是其中具體的作用機(jī)制還有待于深入研究。為本課題miRNAs的研究提供了有力的參考依據(jù)。Ho等還發(fā)現(xiàn)腸道病毒誘導(dǎo)的miR-141能夠通過靶向elF4E進(jìn)而抑制宿主蛋白的表達(dá)。RD細(xì)胞感染EV71后，通過定量PCR檢測(cè)miRNAs的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR-141和miR-146a的表達(dá)增高，其他還有14種miRNAs表達(dá)下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)是研究miRNA在調(diào)節(jié)病毒與宿主的間的相互作用關(guān)系方面取得的又一進(jìn)展。Zheng等發(fā)現(xiàn)EV71感染的細(xì)胞中miR-296-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且miR-296-5p通過靶向病毒基因組抑制病毒的復(fù)制，證明細(xì)胞miRNAs能夠抑制病毒感染。根據(jù)研究報(bào)道病毒感染的細(xì)胞中miR-23b表達(dá)水平顯著下調(diào)，Wen等運(yùn)用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-23b在EV71基因組上的靶位點(diǎn)，并驗(yàn)證了miR-23b能夠通過靶向EV71 3′UTR區(qū)下調(diào)VP1蛋白表達(dá)而抑制EV71的復(fù)制。Li等研究表明miRNA-548靶向IFN-λ1 3′UTR并下調(diào)IFN-λ1的表達(dá)。miRNA-548促進(jìn)EV71的感染，而且病毒感染可抑制miRNA-548，總之miRNA-548能夠通過作用于IFN-λ1而調(diào)節(jié)宿主抗病毒應(yīng)答，研究為抗病毒治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中篩選出的miR373和miR542-5p，經(jīng)過初步驗(yàn)證其能通過靶向EV71基因組的5′UTR區(qū)發(fā)揮作用，從而抑制EV71病毒的復(fù)制。但其具體的調(diào)控EV71病毒復(fù)制的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的 研究。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

miR373 and miR542-5pregulate the replication of Enterovirus 71 in rhabdomyosarcoma cells

Zhuo Yang, and Po Tien

1,,100050,Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and ImmunologyInstitute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijingChina

MicroRNAs (miRNAs) play an important role in infection and replication of virus in host cells. To identify cellular miRNAs involved in the host response to enterovirus 71(EV71) infection,we examined miRNAs effects on the replication of EV71 in rhabdomyosarcoma cells. We constructed target gene of miRNAs screening system. 3′untranslated region (UTR) dual luciferase reporter analysis was used to identify putative miRNA targets in the EV71 virus genome.First, 13 segments of EV71 virus genomes were inserted to the pMIR vector and the luciferase expression were assayed to identify the target gene of putative miRNA. The reporter gene expression of the cells transfected with the vector containing 5′-UTR was significantly downregulated. Then we screened the miRNAs that may target to 5′-UTR using online analysis programs.Furthermore, Western blotting and real-time PCR test were performed to investigate the effect of miRNAs on viral replication. The study showed that miR373 and miR542-5p could suppress the replication of EV71 virus through binding to the 5′-UTR gene. Cellular miRNAs could regulate the replication of EV71 virus in host cells, and our paper should report the role of miR373 and miR542-5p in this regulation for the first time. Our findings supported the notion that the cellular miRNAs might be essential in the host-pathogen interactions.

miRNAs, Enterovirus 71,rhabdomyosarcoma cells, virus replication

November 1, 2013; Accepted: January 8, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 31370201).

Zhuo Yang. Tel: +86-10-83157181; E-mail: zhuoer8623@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31370201) 資助。