農(nóng)桿菌介導(dǎo)LJAMP2基因?qū)搿t陽(yáng)’獼猴桃及分子鑒定

周月1，趙許朋1，吳秀華1，張艷玲1，張林1，羅克明1,2，湯紹虎1,2

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農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因?qū)搿t陽(yáng)’獼猴桃及分子鑒定

周月，趙許朋，吳秀華，張艷玲，張林，羅克明，湯紹虎

1 西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715 2 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

周月, 趙許朋, 吳秀華, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)LJAMP2基因?qū)搿t陽(yáng)’獼猴桃及分子鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 931?942.Zhou Y, Zhao XP, Wu XH, et al.Agrobacterium-mediated transformation of LJAMP2 gene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 931?942.

為了獲得抗?jié)儾〉摹t陽(yáng)’獼猴桃轉(zhuǎn)基因植株，以紅陽(yáng)獼猴桃試管苗葉盤(pán)為轉(zhuǎn)基因受體材料，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的基因?qū)爰t陽(yáng)獼猴桃。450個(gè)葉盤(pán)與攜帶表達(dá)載體質(zhì)粒pBI121的根癌農(nóng)桿菌菌珠L(zhǎng)BA4404共培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)入含25 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d，15 d 轉(zhuǎn)接1次，之后30 d繼代1次。結(jié)果表明，在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA篩選培養(yǎng)基中，Kan芽率達(dá)85%以上，在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培養(yǎng)基中，Kan芽生根率達(dá)100%。共獲得Kan再生植株40株，經(jīng)GUS組織染色和PCR分析證明，其中23株為轉(zhuǎn)基因植株。陽(yáng)性率為57.50%，轉(zhuǎn)化率達(dá)5.11%?？?jié)儾』蛞殉晒?dǎo)入紅陽(yáng)獼猴桃，為紅陽(yáng)獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。

‘紅陽(yáng)’獼猴桃，潰瘍病，基因，遺傳轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌

獼猴桃營(yíng)養(yǎng)極為豐富，被譽(yù)為“水果之王”。到2009年，中國(guó)獼猴桃栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一，分別占全球份額的53%和38%?！t陽(yáng)’獼猴桃為我國(guó)特有紅心品種，果肉翡翠綠色，橫切面自果心向外具放射狀血紅色條紋，總糖含量達(dá)13.45%，高出世界流行品種‘海沃德’近5%，口感特好，堪稱(chēng)獼猴桃極品；2002年被列為世界第3代獼猴桃首選品種；2004年起受?chē)?guó)家原產(chǎn)地產(chǎn)品保護(hù)。其栽培面積日益擴(kuò)大，商品果產(chǎn)量連年增加，而目前產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量尚不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。

獼猴桃屬典型呼吸躍變型果實(shí)，采后室溫下只能貯藏一星期左右。貨架期太短，貯藏和運(yùn)輸不便，采后成本增加；同時(shí)，獼猴桃病蟲(chóng)害每年都會(huì)給主產(chǎn)區(qū)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，獼猴桃潰瘍病傳播迅速，危害程度日趨嚴(yán)重。秦嶺北麓主產(chǎn)區(qū)中華系品種潰瘍病感病園達(dá)90%，感病株達(dá)60%以上，每年因此平均減產(chǎn)20%左右。單純依靠常規(guī)育種和噴灑農(nóng)藥不能有效解決獼猴桃產(chǎn)業(yè)中的突出問(wèn)題，迫切需要以紅陽(yáng)獼猴桃為基礎(chǔ)培育出一個(gè)高抗病性且耐貯保鮮的獼猴桃新品種。

植物基因工程為獼猴桃種質(zhì)改良開(kāi)辟了新途徑。獼猴桃的遺傳轉(zhuǎn)化始于上世紀(jì)90年代，轉(zhuǎn)化方法普遍為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，轉(zhuǎn)化受體從開(kāi)始以莖段、愈傷為主，發(fā)展到近年以葉盤(pán)為主。近年來(lái)，人們將大豆b-1,3-內(nèi)切葡聚糖酶基因、番茄ACC合成酶和獼猴桃ACC氧化酶 (ACO，乙烯合成酶) 反義基因?qū)氆J猴桃，提高了植株的抗病性，獲得了轉(zhuǎn)化苗和降低了ACO基因的表達(dá)量。近年，抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMPs) 在植物基因工程領(lǐng)域廣受關(guān)注。2006年，Yang等從益母草種子中分離到一種新的非專(zhuān)一性脂轉(zhuǎn)移類(lèi)蛋白 (nsLTPs) 的抗菌肽，命名為L(zhǎng)JAMP2。成熟的LJAMP2由91個(gè)氨基酸組成，表觀分子量6.2 kDa，等電點(diǎn)為8.67。煙草、番茄分別轉(zhuǎn)入nsLTPs基因 (、)和后，抗病性顯著提高。Yang等克隆了LJAMP2基因，在煙草、毛白楊和油菜中表達(dá)，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。然而，現(xiàn)有的獼猴桃基因工程報(bào)道，主要進(jìn)行的是遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，實(shí)際轉(zhuǎn)入目的基因的不多，除涉及花器官發(fā)育、激素代謝、耐鹽和果實(shí)呼吸外，涉及抗病基因的太少，LJAMP2基因還未被利用。本試驗(yàn)在趙許朋等成功建立紅陽(yáng)獼猴桃葉盤(pán)高頻直接再生體系基礎(chǔ)上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將導(dǎo)入紅陽(yáng)獼猴桃，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為紅陽(yáng)獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與感染受體

植物材料為‘紅陽(yáng)’獼猴桃 (cv. ‘Red Sun’) 試管苗，由本實(shí)驗(yàn)室保存；感染受體為源于幼嫩葉片的葉盤(pán) (大小約0.5 cm×0.5 cm)。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒為pBI121，其表達(dá)載體：：含有報(bào)告基因、CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因和標(biāo)記基因。質(zhì)粒通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。工程菌株LBA4404由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅克明教授提供。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化

農(nóng)桿菌 (工程菌株LBA4404) 的培養(yǎng)與活化參照高月等的方法進(jìn)行。菌液離心后用含0.1 mmol/L乙酰丁香酮 (AS) 的液體MS培養(yǎng)基重懸浮，然后用于轉(zhuǎn)化。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，將葉盤(pán)接種到出芽培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3 d；放入濃度為=0.5的菌液中，輕微振蕩，侵染10 min；瀝干，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，平放在含0.1 mmol/L AS的出芽培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d(暗培養(yǎng)，25 ℃±2 ℃)；取出，無(wú)菌水沖洗4次，接種到含25 mg/L卡那霉素+400 mg/L羧芐青霉素的出芽培養(yǎng)基上篩選Kan抗性芽 (Kan芽)。前40 d每15 d轉(zhuǎn)接1次 (30 d暗+10 d光照培養(yǎng))，之后每30 d繼代一次 (光照培養(yǎng))。不定芽長(zhǎng)至高3 cm以上時(shí)，切下，先插入固體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，后轉(zhuǎn)入充分吸附液體生根培養(yǎng)基的珍珠巖基質(zhì)中培養(yǎng)15 d (光照培養(yǎng))，得到Kan植株。洗凈其根部基質(zhì)，移栽到溫室營(yíng)養(yǎng)缽中。出芽培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA，不定芽繼代為MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg/L IBA；培養(yǎng)溫度 (25±2) ℃，光照強(qiáng)度4 500 lx (16 h/d)。篩選有關(guān)轉(zhuǎn)化因素的水平時(shí)，變化篩選因素水平，其他因素的水平依此不變。每處理接種8?10個(gè)葉盤(pán)，重復(fù)3?4次。

1.2.3 GUS組織染色與轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)參照尚霄麗等的方法進(jìn)行，檢測(cè)材料為Kan叢芽或Kan植株的葉片。

紅陽(yáng)獼猴桃基因組DNA以葉片為材料采用改良CTAB法提取。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)以GUS陽(yáng)性植株的基因組DNA為模板，通過(guò)擴(kuò)增標(biāo)記基因和目的基因進(jìn)行篩選。根據(jù)Yang等的報(bào)道，分別設(shè)計(jì)特異引物。基因的上游引物序列為5'-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3'，下游引物序列為5'-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3'；基因的上游引物序列為5'-ATGGCTGCCTTGATCAAGTTG-3'，下游引物序列為5'-CAGTGCACCTTTGAGCAATC-3'。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分轉(zhuǎn)化因素水平的確定

2.1.1 卡那霉素 (Kan) 選擇壓的確定

將葉盤(pán)直接接種在含不同濃度Kan的出芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4?6周。結(jié)果 (表1) 表明，在未添加Kan的培養(yǎng)基中，葉盤(pán)分化正常。培養(yǎng)6周后，出芽率達(dá)100%，每個(gè)葉盤(pán)平均出芽18個(gè)以上 (圖1A)；隨著培養(yǎng)基中Kan濃度的升高，葉片分化受到明顯抑制。Kan=20 mg/L時(shí)，培養(yǎng)6周后葉片雖能脫分化和低頻 (8.56%) 產(chǎn)生愈傷組織，但不能分化出不定芽；Kan≥25 mg/L時(shí)，愈傷組織和不定芽的形成完全被抑制，外植體逐漸褐化、死亡 (圖1B)，說(shuō)明紅陽(yáng)獼猴桃葉片在直接再生不定芽的過(guò)程中對(duì)Kan比較敏感。因此，在本試驗(yàn)中，用于葉盤(pán)轉(zhuǎn)化的Kan選擇壓確定為25 mg/L。

2.1.2 羧芐青霉素 (Carb) 和頭孢霉素 (Cef) 抑菌濃度的確定

葉盤(pán)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后，接種到含不同濃度Carb和Cef的出芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周。結(jié)果 (表2) 表明，100?600 mg/L Cef不能抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。100?500 mg/L Cef時(shí)，葉盤(pán)因污染全部死亡；600 mg/L Cef時(shí)，葉盤(pán)成活率僅2.14%。而100?500 mg/L Carb能不同程度地抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。隨著Carb濃度的提高，葉盤(pán)成活率提高。200 mg/L Carb時(shí) (圖1C)，平均成活率較低 (8.93%)；400 mg/L和 500 mg/L Carb時(shí)，成活率達(dá)100%。但500 mg/L Carb明顯影響不定芽再生，而400 mg/L Carb無(wú)明顯影響 (圖1D)。因此，本試驗(yàn)采用 400 mg/L Carb抑制共培養(yǎng)后篩選過(guò)程中農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

2.1.3 葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)和農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響

葉盤(pán)在農(nóng)桿菌侵染前經(jīng)不同時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)前用農(nóng)桿菌侵染不同時(shí)間，并在抗性篩選結(jié)束后，取Kan芽的葉片進(jìn)行GUS染色。試驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)1?5 d后，轉(zhuǎn)化率 (以瞬時(shí)表達(dá)率表示，后同) 均顯著提高，分別比對(duì)照 (61.78%) 提高9.02%、25.07%、41.39%、36.16%和21.95% (圖2A)。其中，預(yù)培養(yǎng)3 d的轉(zhuǎn)化率最高 (87.35 %)，且與預(yù)培養(yǎng)1 d、2 d和5 d均存在顯著差異 (≤0.05)，僅與4 d無(wú)顯著差異 (＞0.05)。因此，本試驗(yàn)葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)的適宜時(shí)間為3 d。

農(nóng)桿菌侵染0.5?30 min后，其轉(zhuǎn)化率的變化趨勢(shì)與葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)相同 (圖2B)。其中，侵染10 min轉(zhuǎn)化率最高 (57.20%)，比0.5、5、15和30 min分別提高140.34%、23.81%、33.64%和21.34倍，且與它們均存在顯著差異。因此，本試驗(yàn)農(nóng)桿菌侵染的最佳時(shí)間為10 min。

表1 Kan對(duì)葉片外植體愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響

Note: different letters a, b, c, d in a column mean significant difference in different samples (≤0.05). The same as table 2.

圖1 抗生素對(duì)‘紅陽(yáng)’獼猴桃葉片不定芽分化的影響

表2 羧芐青霉素和頭孢霉素對(duì)選擇培養(yǎng)中外植體成活率的影響

圖2 葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)(A) 和農(nóng)桿菌侵染時(shí)間(B) 對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響

2.1.4 乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響

葉盤(pán)被農(nóng)桿菌侵染后在共培養(yǎng)期間，于共培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙酰丁香酮 (AS)，取Kan芽的葉片進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，AS對(duì)轉(zhuǎn)化頻率有顯著影響 (圖3)。培養(yǎng)基中添加 0.1、0.2、0.3和0.5 mmol/L AS時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率比對(duì)照 (58.67%) 分別提高25.16%、22.99%、15.66%和6.07%。其中，添加 0.1、0.2和0.3 mmol/L AS時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率與對(duì)照均存在顯著差異，而相互間無(wú)顯著差異。因此，本試驗(yàn)確定在共培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L AS，以提高紅陽(yáng)獼猴桃葉盤(pán)的遺傳轉(zhuǎn)化頻率。

圖3 乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響

2.2 抗性植株葉片的GUS染色

本試驗(yàn)通過(guò)葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)，共獲得獨(dú)立的Kan植株40株，移栽后生長(zhǎng)正常 (圖4A)。因植物表達(dá)載體：：含有報(bào)告基因，故首先對(duì)Kan植株的葉片進(jìn)行GUS組織染色。結(jié)果表明，在被檢測(cè)的40株Kan植株中，有23株呈藍(lán)色 (圖4B)，為GUS陽(yáng)性再生植株；其余17株和未轉(zhuǎn)化的植株沒(méi)有顯示出藍(lán)色 (圖4C)。初步表明外源目的基因已整合到紅陽(yáng)獼猴桃部分Kan植株的基因組中。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

對(duì)23株GUS陽(yáng)性再生植株，以其基因組DNA為模板，以：：質(zhì)粒DNA (圖5A) 為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA為陰性對(duì)照，利用特異性引物，分別對(duì)標(biāo)記基因和目的進(jìn)行PCR擴(kuò)增。部分GUS陽(yáng)性再生植株 (8株) 的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖5B、圖5C所示。在以GUS陽(yáng)性植株的基因組DNA和載體質(zhì)粒為模板，以基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，GUS陽(yáng)性植株均獲得1條與預(yù)期結(jié)果大小一致的片段 (749 bp)，而非轉(zhuǎn)化 (野生型) 植株未擴(kuò)增出特異條帶 (圖5B)；在對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，GUS陽(yáng)性植株皆得到1條與質(zhì)粒作模板擴(kuò)增條帶大小相同的條帶，而非轉(zhuǎn)化植株基因組做模板也未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖5C)。其余15株GUS陽(yáng)性再生植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果與此相同 (未列出) 。上述檢測(cè)結(jié)果證明，外源目的基因已成功整合到紅陽(yáng)獼猴桃GUS陽(yáng)性植株的基因組上。

圖4 轉(zhuǎn)基因‘紅陽(yáng)’獼猴桃的GUS組織化學(xué)染色

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)NPTⅡ、LJAMP2基因結(jié)果

本試驗(yàn)共轉(zhuǎn)化葉盤(pán)450個(gè)，出芽率在85%以上，Kan芽生根率達(dá)100%。共獲得Kan植株40株，Kan植株獲得率為8.89%；經(jīng)GUS染色和PCR檢測(cè)，40株Kan植株中23株呈陽(yáng)性，陽(yáng)性植株獲得率為57.50%。整體轉(zhuǎn)化頻率達(dá)5.11%。

3 討論

3.1 關(guān)于‘紅陽(yáng)’獼猴桃的遺傳轉(zhuǎn)化條件

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌與植物組織共同作用的復(fù)雜過(guò)程，凡涉及到農(nóng)桿菌活性和受體細(xì)胞生理狀態(tài)的所有因素都可能影響到轉(zhuǎn)化效果。

3.1.1 Kan選擇壓與葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，需要根據(jù)篩選標(biāo)記基因的性質(zhì)，選擇合適的抗生素來(lái)篩選抗性芽。而濃度過(guò)低，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性抗性芽和大量嵌合體；濃度過(guò)高，會(huì)延緩抗性芽分化，甚至造成外植體褐化、死亡。

Kan能抑制細(xì)胞中核糖體蛋白質(zhì)的合成，一定濃度時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，適宜的Kan選擇壓為25 mg/L。這與郭衛(wèi)東等的研究結(jié)果一致，而與Honda等(50 mg/L)和Han等(150 mg/L) 的不一致。主要原因是不同品種因基因型不同，耐Kan能力存在差異。

侵染前對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，因而更易整合外源DNA，從而提高轉(zhuǎn)化率。在本試驗(yàn)中，葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)的適宜時(shí)間為3 d。這與郭衛(wèi)東等的研究結(jié)果一致，而與Wang等 (4周)相差較大。主要原因可能是葉盤(pán)在侵染前生理差異太大。

3.1.2 農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)時(shí)間

農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)時(shí)間是整個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化中最重要的2個(gè)因素，因?yàn)檗r(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合都在這個(gè)時(shí)期完成。時(shí)間太短，不能完成轉(zhuǎn)化；時(shí)間太長(zhǎng)，篩選時(shí)難以脫菌，甚至由于農(nóng)桿菌的毒害和選擇壓力的存在造成外植體褐化、死亡。農(nóng)桿菌侵染時(shí)間一般不超過(guò)30 min，共培養(yǎng)時(shí)間一般應(yīng)長(zhǎng)于16 h。

在本試驗(yàn)中，農(nóng)桿菌侵染的最佳時(shí)間為10 min。這與郭衛(wèi)東等的研究結(jié)果一致，而與宋喜貴等 (15 min)和苑平等 (30 min)不一致。

尚霄麗等認(rèn)為，不同品種的獼猴桃共培養(yǎng)時(shí)間不同，大多數(shù)以2?4 d轉(zhuǎn)化率較高。在已有報(bào)導(dǎo)中，共培養(yǎng)時(shí)間，有的為2 d，多數(shù)為3?4 d。在本試驗(yàn)中，我們根據(jù)高月等的研究報(bào)道并結(jié)合實(shí)際預(yù)試結(jié)果，將共培養(yǎng)時(shí)間確定為2 d。

3.1.3 轉(zhuǎn)化過(guò)程中AS的作用

根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移起介導(dǎo)作用，而植物受傷細(xì)胞分泌的某些酚類(lèi)化合物 (AS等) 對(duì)根癌農(nóng)桿菌Vir基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。因此，在菌液或共培養(yǎng)基中添加一定濃度AS，通?？商岣咿D(zhuǎn)化率。本試驗(yàn)在共培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L AS后，轉(zhuǎn)化率提高。這與苑平等的研究結(jié)果一致，而與尚霄麗等 (0.2 mmol/L)不一致。這可能與不同品種葉盤(pán)的生理狀態(tài)，尤其與自身AS含量有關(guān) (本試驗(yàn)和部分此列文獻(xiàn)中侵染菌液含AS)。

3.1.4 菌液濃度與抗生素抑菌濃度

菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響同侵染與共培養(yǎng)時(shí)間相同。一般認(rèn)為適宜的菌液濃度=0.5左右。在已有報(bào)導(dǎo)中，菌液濃度 (值) 有的為0.5，有的0.6，個(gè)別較低 (0.3)，個(gè)別很高 (1?1.5)。本試驗(yàn)根據(jù)高月等的報(bào)道，結(jié)合實(shí)際預(yù)試結(jié)果，把菌液濃度確定為=0.5。

抗生素抑菌濃度主要與農(nóng)桿菌對(duì)所用抗生素的敏感性、菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。在本試驗(yàn)中，通過(guò)不同濃度Carb和Cef的比較試驗(yàn)，結(jié)果在Kn芽的篩選過(guò)程中，除菌效果Carb明顯優(yōu)于Cef，其最適濃度為400 mg/L。

顯然，不同農(nóng)桿菌菌株的侵染能力、轉(zhuǎn)化時(shí)菌株的活化狀態(tài)、植物受體的生理狀態(tài)和對(duì)抗生素的耐受性都不盡相同，即使菌液濃度和侵染時(shí)間相同，同品種獼猴桃在不同試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化率也會(huì)存在差異。因此，在特定品種的遺傳轉(zhuǎn)化中，在確定所用菌株和抗生素后，只有努力造就菌株和受體良好的生理狀態(tài)，同時(shí)采用適宜的菌液濃度、侵染與共培養(yǎng)時(shí)間以及抗生素濃度，才能獲得較高的轉(zhuǎn)化率。

目前，在獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化中，Kan芽得率一般在4%左右。本試驗(yàn)Kan芽得率雖然較高 (8.89%)，但與其葉盤(pán)直接再生頻率 (100%) 相差甚遠(yuǎn)，而且整體轉(zhuǎn)化頻率 (5.11%) 也還不高。因此，本試驗(yàn)中的遺傳轉(zhuǎn)化條件還需優(yōu)化，尤其是菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等因素的使用水平還應(yīng)進(jìn)一步篩選。

3.2 關(guān)于獼猴桃的潰瘍病和基因工程育種

作物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的突出問(wèn)題，其損失占糧食總產(chǎn)量的10%?15%，而植物病原菌突變頻率上升和抗藥性增強(qiáng)是病害大發(fā)的根本原因。潰瘍病是獼猴桃栽培中最具毀滅性的病害，由細(xì)菌類(lèi)的丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種 (pv.) 引起，其適生范圍廣、發(fā)生迅猛、致病性強(qiáng)、難以根除，可在短期內(nèi)造成大面積樹(shù)體死亡。潰瘍病現(xiàn)已在我國(guó)四川、陜西、安徽、湖南和福建等省的獼猴桃栽培區(qū)域發(fā)生，是獼猴桃生產(chǎn)面臨的重大問(wèn)題。

抗菌肽也稱(chēng)抗菌蛋白 (Antimicrobial proteins，AMPs)。在植物抗病基因工程中，AMPs顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。AMPs廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，主要作用于細(xì)胞膜而實(shí)現(xiàn)廣譜殺菌作用。近年來(lái)，人們將不同來(lái)源的抗菌肽導(dǎo)入植物，獲得了一些抗病轉(zhuǎn)基因植株。

本試驗(yàn)針對(duì)獼猴桃栽培中的突出問(wèn)題，在國(guó)內(nèi)外首次利用抗?jié)儾〉腁MPs基因轉(zhuǎn)化紅陽(yáng)獼猴桃，在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展獼猴桃抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了經(jīng)GUS組織染色和PCR鑒定的轉(zhuǎn)基因植株，這將有助于紅陽(yáng)獼猴桃的基因工程研究，從而促進(jìn)獼猴桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。當(dāng)然，本試驗(yàn)所獲得的轉(zhuǎn)基因植株還需通過(guò)Southern等分子雜交和RT-PCR等目的基因的表達(dá)分析以進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性。構(gòu)建雙價(jià)或多價(jià)轉(zhuǎn)化載體，同時(shí)將抗病、耐貯基因?qū)爰t陽(yáng)獼猴桃，以期培育出既抗病又耐貯的獼猴桃新品種，應(yīng)當(dāng)是今后我國(guó)獼猴桃基因工程育種的主攻方向。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

-mediated transformation ofgene into ‘Red Sun’ kiwifruit and its molecular identification

Yue Zhou, Xupeng Zhao, Xiuhua Wu, Yanling Zhang, Lin Zhang, Keming Luo, and Shaohu Tang

1 Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Bacterial canker caused bypv.is one of the most important diseases of kiwifruit () and leads to considerable yield losses. In order to obtain transgenic plants with resistance for ‘Red Sun’ kiwifruit to canker disease, a non-specific lipid transfer protein-like antimicrobial protein gene () from motherwort () was introduced into ‘Red Sun’kiwifruit through-mediated transformation. After two days of co-cultivation withstrain LBA4404 harboring:the transformed explants were transferred to the selection medium containing 25 mg/Lkanamycin+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA. The regeneration efficiency of kanamycin-resistant shoots reached to 85%. All (100%) of kanamycin-resistant shoots rooted on half-strength MS medium supplemented with 0.8 mg/L IBA and a total of 40 regenerated plantlets were obtained. PCR and histochemical GUS activity analysis show that 23 of 40 lines (57.50%) were positive, suggesting that thegene was integrated into the genome of ‘Red Sun’kiwifruit. Taken together, we established an efficient genetic transformation method for ‘Red Sun’ kiwifruit usings and the transformation frequency reached 5.11%. This protocol will be useful for the genetic breeding of ‘Red Sun’ kiwifruit for improvement of disease resistance.

‘Red Sun’kiwifruit (), canker disease,gene, genetic transformation,

September 13, 2013; Accepted:December 6, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 30871576).

Shaohu Tang. Tel:+86-23-68252838; E-mail: tangsh@swu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30871576) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-02-12

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130479.html