長(zhǎng)效人促卵泡激素CHO細(xì)胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)活性

黃曉平1,2，王曉1,2，楊春雪1,2，賈東方1,2，林俊生1,2，刁勇1,2

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長(zhǎng)效人促卵泡激素CHO細(xì)胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)活性

黃曉平，王曉，楊春雪，賈東方，林俊生，刁勇

1 華僑大學(xué)分子藥物研究院，福建泉州 362021 2 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建泉州 362021

黃曉平, 王曉, 楊春雪, 等. 長(zhǎng)效人促卵泡激素CHO細(xì)胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)活性. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 954?961.Huang XP, Wang X, Yang CX, et al.Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity in vivo. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 954?961.

促卵泡激素 (FSH) 是具有促進(jìn)卵泡與睪丸發(fā)育作用的一種垂體糖蛋白激素。因其體內(nèi)半衰期較短，臨床上需要連續(xù)10 d以上每天注射，病人使用非常不方便。本文旨在通過(guò)提高糖基化程度，研制一種長(zhǎng)效FSH。通過(guò)一段含有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的連接序列, 將人FSH α鏈與β鏈cDNA融合，并插入pcDNA3.1(+)表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后，通過(guò)G418篩選得到陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，并經(jīng)PCR和Western blotting證實(shí)。該重組FSH為單鏈蛋白，分子量約為49 kDa。經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)，工程細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中重組FSH的表達(dá)量可達(dá)3 mg/L。單次注射該重組FSH能夠促進(jìn)大鼠卵巢發(fā)育與卵泡成熟，且藥效與連續(xù)8次注射Folltropin-V的相近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究已成功獲得一種長(zhǎng)效重組FSH。

促卵泡激素，CHO-K1細(xì)胞，長(zhǎng)效，無(wú)血清培養(yǎng)

促卵泡激素 (FSH) 是由α和β兩個(gè)亞基組成的一種糖蛋白，兩個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)結(jié)合形成二聚體。FSH的α-亞基與其他糖蛋白激素，如絨毛膜促性腺激素(CG)、黃體素(LH) 和促甲狀腺激素(TSH) 的α-亞基完全相同，而各糖蛋白激素的β-亞基則在結(jié)構(gòu)上稍有差異, 從而賦予每種激素不同的生物功能。研究表明FSH的α亞基羧基端與其受體結(jié)合緊密，因此進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)都采用β亞基在后，α亞基在前提供游離的α亞羧基的連接方式。

目前市售的FSH制劑大部分是從尿液或者動(dòng)物垂體中提取而來(lái)，但這些產(chǎn)品仍存在一定的局限性，例如半衰期短、產(chǎn)品純度低、活性差，或因含有他激素和潛在的傳染性病原而影響藥物的療效，已經(jīng)不能滿足如今市場(chǎng)的需求，而采用基因工程的方法可以獲得純度高、活性優(yōu)的重組FSH。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO) 是廣泛用于生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，能對(duì)復(fù)雜糖蛋白進(jìn)行很好地折疊、組裝和翻譯后修飾，在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等方面更接近天然蛋白。目前已經(jīng)上市的重組糖蛋白類藥物基本上由CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得。FSH β鏈中含有N7和 N24兩個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，而α鏈也含有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，故本課題選擇CHO表達(dá)系統(tǒng)。

FSH是正常婦女卵泡生長(zhǎng)、成熟和男子精子生成所必不可少的一種糖蛋白。在當(dāng)前輔助生殖周期的10–12 d中，普通FSH的制劑需要每天皮下注射1次或者2次，這種反復(fù)注射給患者帶來(lái)了諸多不便。目前已有諸多方法來(lái)延長(zhǎng)蛋白藥物的半衰期，如化學(xué)修飾法、單鏈融合CTP、增加 N-連接糖基化等。Klein等研究表明，重組FSH在體內(nèi)的半衰期為3.7 h，而增加2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的重組長(zhǎng)效FSH在體內(nèi)的半衰期為7.3 h，是普通FSH半衰期的2倍。

本課題采用含有2個(gè)N-連糖基化的連接序列，將FSH α鏈與β鏈融合成單鏈。α鏈位于融合蛋白的羧基端，提供游離的羧基，有利于重組FSH與其受體更為緊密的結(jié)合，β鏈位于融合蛋白的氨基端。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞、G418篩選得到單克隆，進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)上清進(jìn)行Western blotting分析和大鼠體內(nèi)活性分析，為長(zhǎng)效FSH制劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DH5α、pcDNA3.1 (+) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。CHO-K1細(xì)胞株購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。T4 DNA 連接酶、dⅢ、RⅠ、1406Ⅰ等限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自碧云天公司。胎牛血清 (FBS) 購(gòu)自Hyclone公司。F-12K營(yíng)養(yǎng)混合培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo scientific公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。G418購(gòu)自Amersco公司。Folltropin-V (Belleville, Canada)，兔抗人FSH一抗，山羊抗兔二抗均購(gòu)自Abcam公司。ELISA購(gòu)自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-FSH的構(gòu)建

按照文獻(xiàn)[22]中的方法，使用N-連接糖基化的連接序列(氨基酸序列GSGSNATGSG SNATSGSTS)，融合人FSH α鏈與β鏈。全基因序列由南京金斯瑞公司合成，目的基因經(jīng)d Ⅲ與RⅠ酶切、回收，目的基因克隆至pcDNA3.1(+)載體的d Ⅲ/RⅠ位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定與質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.2 CHO-K1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

CHO-K1細(xì)胞用含10% FBS的F-12K營(yíng)養(yǎng)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO濃度為5%。待細(xì)胞匯合度至85%時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成懸液，接種至24孔板中。待細(xì)胞匯合度至80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，2 μL Lipofectamine 2000與0.8 μg經(jīng)過(guò)1406Ⅰ線性化的pcDNA3.1(+)-FSH質(zhì)?；旌虾?，均勻加至含10% FBS的F-12K營(yíng)養(yǎng)混合培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h，胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，按照1∶10比例進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，加入終濃度為800 μg/mL G418進(jìn)行篩選，每3 d換一次液，直至多克隆細(xì)胞形成。

1.2.3 穩(wěn)定表達(dá)FSH細(xì)胞系的篩選與鑒定

將多克隆細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，倍比稀釋的方法篩選單克隆細(xì)胞，取單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，將表達(dá)量較大的單克隆細(xì)胞進(jìn)行多次單克隆篩選得到穩(wěn)定表達(dá)FSH的細(xì)胞系，并命名為CHO-FSH。培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)印至PVDF上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，兔抗人FSH一抗室溫孵育2 h，PBST (PBS+0.1%Twen-20) 漂洗3 次，羊抗兔二抗室溫孵育2 h，漂洗3次，ECL顯色成像。

分別以篩選得到的4株單克隆細(xì)胞系基因組和CHO-K1細(xì)胞的基因組為模板，以Forward (5′-TTAAGCTTATGAAGACACTCC AGTTTTTCTTCC-3′) 和Reverse (5′-TTGAATTC TTAAGATTTGTGATAATAACAAGTA-3′)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定FSH基因是否已整合至CHO-K1細(xì)胞基因組中。

1.2.4 重組FSH體內(nèi)活性分析

大鼠卵巢、子宮增重是測(cè)定促卵泡激素生物學(xué)活性最經(jīng)典、最可靠的方法。子宮內(nèi)含有大量的雌激素受體 (ERS)，雌激素通過(guò)與該受體結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而表現(xiàn)為子宮組織增生。選取20–23日齡SD雌性大鼠，隨機(jī)分成重組FSH高劑量組 (62.5 μg/kg)、中劑量組 (12.5 μg/kg)、低劑量組 (2.5 μg/kg)、Folltropin-V 0.5 g/kg 8次注射組 (每天2次，連續(xù)注射4 d)、Folltropin-V 0.5 g/kg組 (單次注射) 和生理鹽水陰性對(duì)照組。腹腔皮下注射重組FSH、陽(yáng)性藥物 (Folltropin-V) 或生理鹽水。給藥4 d后，處死大鼠，剝離出卵巢與子宮稱重。多聚甲醛固定卵巢，切片、HE染色、鏡檢分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-FSH的構(gòu)建

轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果雙酶切所得的片段大小與設(shè)計(jì)的相符，約750 bp (圖1)，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的基因序列比對(duì)結(jié)果一致，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)FSH細(xì)胞系的PCR鑒定

以篩選得到的4株單克隆細(xì)胞系和CHO-K1細(xì)胞基因組DNA為模板，利用FSH特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果以4株單克隆細(xì)胞系基因組為模板的PCR產(chǎn)物，得到約750 bp目的片段 (圖2)，與設(shè)計(jì)的FSH基因大小相符，而以CHO-K1細(xì)胞基因組為模板的PCR產(chǎn)物，沒(méi)有檢測(cè)到FSH特異性的750 bp條帶，證明FSH基因已整合到CHO-K1 細(xì)胞基因組中。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FSH的PCR和酶切鑒定

圖2 PCR法鑒定CHO-FSH陽(yáng)性細(xì)胞株

2.3 培養(yǎng)上清液的Western blotting分析

培養(yǎng)上清的Western blotting結(jié)果顯示，在 49 kDa 左右有明顯的印記 (圖3)。證實(shí)篩選得到的細(xì)胞系能表達(dá)FSH，進(jìn)一步用ELISA進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清液中重組FSH表達(dá)量為3 mg/L。

2.4 重組FSH對(duì)大鼠卵巢的影響

大鼠卵巢重量分析 (圖4)，結(jié)果顯示注射重組FSH組，卵巢重量與藥物劑量之間呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。重組FSH 62.5 μg/kg 組與陰性對(duì)照組相比具有顯著性差異 (<0.01)；重組FSH 62.5 μg/kg組與連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組相比沒(méi)有顯著性差異 (>0.05)；連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對(duì)照組相比具有顯著性差異 (<0.01)；而單次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異 (>0.05)。重組FSH 62.5 μg/kg、 12.5 μg/kg 組和連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組，大卵泡的數(shù)目(直徑>275 μm) 與陰性對(duì)照組相比具有顯著性的差異 (<0.05)；重組FSH 62.5 μg/kg組與連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 組相比沒(méi)有顯著性差異 (>0.05);而單次注射Folltropin-V 0.5g/kg組和重組FSH 2.5 μg/kg組，與陰性對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性的差異 (>0.05) (圖5)。結(jié)果表明在卵巢、子宮增重和促進(jìn)卵泡成熟的藥效上，我們得到的重組長(zhǎng)效FSH單次注射的藥效與連續(xù)8次注射陽(yáng)性藥物Folltropin-V的藥效相近。

2.5 長(zhǎng)效FSH對(duì)大鼠子宮的影響

大鼠注射重組FSH和Folltropin-V結(jié)果顯示：重組FSH 62.5 μg /kg組子宮增重非常明顯，與正常組相比具有顯著性差異 (<0.01)；重組FSH 12.5 μg/kg 組與陰性對(duì)照組相比具有顯著性差異 (<0.05)，連續(xù)8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg組與陰性對(duì)照組相比具有顯著性差異 (<0.05)；而單次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 組與陰性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異 (>0.05) (圖6)。

圖3 重組FSH Western blotting鑒定

圖4 重組FSH、Folltropin-V對(duì)大鼠卵巢增重的影響

圖5 重組FSH、Folltropin-V對(duì)大鼠卵泡成熟的影響

圖6 重組FSH、Folltropin-V對(duì)大鼠子宮增重的影響

3 討論

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展, 蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)在臨床治療中發(fā)揮重要的作用，然而大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的生物半衰期普遍較短, 一方面是蛋白藥物被體內(nèi)大量存在的蛋白酶所分解, 另一方面是分子質(zhì)量小的蛋白分子容易被腎小球?yàn)V過(guò)而經(jīng)腎臟排泄清除。為了維持療效，往往需要頻繁用藥, 長(zhǎng)期的反復(fù)注射不僅增加了患者的痛苦, 而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。因此迫切需要延長(zhǎng)蛋白藥物的半衰期來(lái)避免反復(fù)注射帶來(lái)的諸多不便，目前第一個(gè)長(zhǎng)效FSH制劑corifollitropin α已經(jīng)上市。

本文使用含N-糖基化位點(diǎn)的連接序列，將FSHα與β亞基融合成單鏈，表達(dá)的長(zhǎng)效FSH為單亞基結(jié)構(gòu)，而不是二亞基結(jié)構(gòu)，融合FSH蛋白α羧基端是處于游離狀態(tài)，能與其受體結(jié)合，且β亞基位于融合蛋白的N端，而并沒(méi)有影響FSH的生物活性。重組長(zhǎng)效FSH蛋白能夠促進(jìn)大鼠卵巢的增重、卵泡的成熟和子宮的增重。單次注射62.5 μg/kg 重組FSH與連續(xù)8次注射0.5 g/kg Folltropin-V在卵巢、子宮增重和促進(jìn)卵泡成熟的藥效相當(dāng)。以上的結(jié)果表明我們得到的重組FSH蛋白能延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期。

本研究獲得的工程細(xì)胞株經(jīng)過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基馴化，懸浮生長(zhǎng)，有利于培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大。搖瓶中表達(dá)量達(dá)3 mg/L，比文獻(xiàn)中報(bào)道的表達(dá)量要高。此穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)效FSH細(xì)胞株的獲得，為下一步研制開發(fā)長(zhǎng)效FSH蛋白藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的臨床基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Kim DJ, Seok SH, Baek MW, et al. Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation. Fertil Steril, 2010, 93(8): 2652–2660.

[2] Ulloa-Aguirre A, Timossi C. Structure-function relationship of follicle-stimulating hormone and its receptor. Hum Reprod Update, 1998, 4(3): 260–283.

[3] Kumar TR, Wang Y, Lu N, et al. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nat Genet, 1997, 15(2): 201–204.

[4] Fan QR, Hendrickson WA. Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor. Nature, 2005, 433: 269–277.

[5] Fan QR, Hendrickson WA. Comparative structural analysis of the binding domain of follicle stimulating hormone receptor. Proteins, 2008, 72(1): 393–401.

[6] Ruman JI, Pollak S, Trousdale RK, et al. Effects of long-acting recombinant human follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation on murine folliculogenesis. Fertil Steril, 2005, 83(4): 1303–1309.

[7] Weenen C, Pena J, Pollak S, et al. Long-acting follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation exhibited increased bioactivity compared with O-linked analogs in female rats. J Clin Endocr Metab, 2004, 89(10): 5204–5212.

[8] Hugues JN. Recombinant human follicle-stimulating hormone: a scientific step to clinical improvement. Reprod Biomed Online, 2001, 2(1): 54–64.

[9] Yang HL, Zhao XB, Song XJ, et al. Expression of goat follicle-stimulating hormone analogous gene in. Chin J Biotech, 2008, 24(3): 409–414 (in Chinese).楊歡利, 趙西彪, 宋曉娟, 等. 山羊重組促卵泡素長(zhǎng)效類似物基因在畢赤酵母中表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(3): 409–414.

[10] Kumar TR, Schuff KG, Nusser KD, et al. Gonadotroph-specific expression of the human follicle stimulating hormone beta gene in transgenic mice. Mol Cell Endocrinol, 2006, 247(1/2): 103–115.

[11] Howles CM. Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod Update, 1996, 2(2): 172–191.

[12] De Leo V, Musacchio MC, Di Sabatino A, et al. Present and future of recombinant gonadotropins in reproductive medicine. Curr Pharm Biotechnol, 2012, 13(3): 379–391.

[13] Kim JY, Kim YG, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol, 2012, 93(3): 917–930.

[14] Gibreel A, Bhattacharya S. Recombinant follitropin alfa/lutropin alfa in fertility treatment. Biologics, 2010, 4: 5–17.

[15] Demeestere I, Streiff AK, Suzuki J, et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development1. Biol Reprod, 2012, 87(1): 1–11.

[16] Sterrenburg M, Veltman-Verhulst S, Eijkemans M, et al. Clinical outcomes in relation to the daily dose of recombinant follicle-stimulating hormone for ovarian stimulation infertilization in presumed normal responders younger than 39 years: a meta-analysis. Hum Reprod Update, 2011, 17(2): 184–196.

[17] Allan CM, Couse JF, Simanainen U, et al. Estradiol induction of spermatogenesis is mediated via an estrogen receptor-α mechanism involving neuroendocrine activation of follicle-stimulating hormone secretion. Endocrinology, 2010, 151(6): 800–810.

[18] Olivius C, Friden B, Borg G, et al. Why do couples discontinuefertilization treatment? A cohort study. Fertil Steril, 2004, 81(2): 258–261.

[19] Klein J, Lobel L, Pollak S, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotropin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey. Fertil Steril, 2002, 77(6): 1248–1255.

[20] Devroey P, Fauser B, Platteau P, et al. Induction of multiple follicular development by a single dose of long-acting recombinant follicle-stimulating hormone (FSH-CTP, corifollitropin alfa) for controlled ovarian stimulation beforefertilization. J Clin Endocr Metab, 2004, 89(5): 2062–2070.

[21] Pouwer AW, Farquhar C, Kremer J. Long-acting FSH versus daily FSH for women undergoing assisted reproduction. Cochrane Database Syst Rev, 2012, 6: CD009577.

[22] Diao Y, Lin JS. The molecular design and drug development of recombinant long-acting follicle stimulating hormone. Acta Pharm Sin, 2012, 47(4): 421–426 (in Chinese).刁勇，林俊生. 長(zhǎng)效卵泡刺激素的分子設(shè)計(jì)與新藥開發(fā). 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(4): 421–426.

[23] Fares F, Ganem S, Hajouj T, et al. Development of a long-acting erythropoietin by fusing the carboxyl-terminal peptide of human chorionic gonadotropin β-subunit to the coding sequence of human erythropoietin. Endocrinology, 2007, 148(10): 5081–5087.

[24] Weenen C, Pena JE, Pollak SV, et al. Long-acting follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation exhibited increased bioactivity compared with O-linked analogs in female rats. J Clin Endocr Metab, 2004, 89(10): 5204–5212.

[25] Klein J, Lobel L, Pollak S, et al. Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist. Hum Reprod, 2003, 18(1): 50–56.

[26] Shelby MD, Newbold RR, Tully DB, et al. Assessing environmental chemicals for estrogenicity using a combination ofandassays. Environm Health Perspect, 1996, 104(12): 1296.

[27] Seyhan A, Ata B. The role of corifollitropin alfa in controlled ovarian stimulation for IVF in combination with GnRH antagonist. Int J Womens Health, 2011, 3: 243–255.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity

Xiaoping Huang, Xiao Wang, Chunxue Yang, Dongfang Jia, Junsheng Lin, and Yong Diao

1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China 2 School of Biomedical Sciences Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is essential for the development of ovarian follicles and testicular seminiferous tubules. The relatively short half-life of FSHrequires daily injections for more than 10 days that is inconvenient and possibly contribute to the stress perceived by the patients. The goal of the present study was to increase FSH glycosylation, in order to develop a long-acting recombinant FSH. The cDNA of native α and β subunit of human FSH was linked by a sequence with two N-linked glycosylation sites, and the resulted DNA was inserted into pcDNA3.1 vector to generate a recombinant vector of pcDNA3.1-FSH. The pcDNA3.1-FSH was linearized and transfected into CHO-K1, positive transformants were selected by G418 and confirmed by PCR and Western blotting. A single chain recombinant FSH was expressed, with molecular weight of about 49 kDa. The recombinant FSH expression level in CHO-K1 cell strain in serum-free culture was 3 mg/L. Single injection of this recombinant FSH could induce folliculogenesis and ovulation in rats, the efficacy was similar with the commercially available FSH preparation (Folltropin-V) administrated 8 times consecutively. The results suggested a long-acting FSH was produced successfully.

follicle-stimulating hormone, Chinese hamster ovary cells, long acting, serum-free culture

September 12, 2013; Accepted:November 15, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 81271691), Program for International S&T Cooperation Projects of China (No. 2011DFG33320), Key Science & Technology Project of the Fujian Province, China (No. 2013N5007), Project of Huaqiao University (No. 11HZR19).

Yong Diao. Tel/Fax: +86-595-22692516; E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81271691)，國(guó)際科技合作項(xiàng)目 (No. 2011DFG33320)，福建省科技重大項(xiàng)目 (No. 2013N5007)，華僑大學(xué)校級(jí)基金 (No. 11HZR19) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2013-12-17

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