鈉離子通道疾病及其抑制劑生物學(xué)功能研究進展

王紅艷，勾萌，肖蓉，李慶偉

?

鈉離子通道疾病及其抑制劑生物學(xué)功能研究進展

王紅艷，勾萌，肖蓉，李慶偉

遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081

王紅艷, 勾萌, 肖蓉, 等. 鈉離子通道疾病及其抑制劑生物學(xué)功能研究進展. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(6): 875?890.Wang HY, Gou M, Xiao R, et al. Progress in the sodium channelopathies and the biological functions of voltage-gated sodium channel blockers. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 875?890.

電壓門控型鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel, VGSC) 廣泛分布于興奮性細胞，是電信號擴大和傳導(dǎo)的主要介質(zhì)，在神經(jīng)細胞以及心肌細胞興奮傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能的異常會改變細胞的興奮性，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)性疼痛、癲癇，以及心律失常等。目前臨床上多采用鈉離子通道抑制劑治療上述疾病。近些年，研究人員陸續(xù)從動物的毒液中分離純化出具有調(diào)控鈉離子通道功能的神經(jīng)毒素。這些神經(jīng)毒素多為化合物或小分子多肽。現(xiàn)已有醫(yī)藥研發(fā)公司將這些天然的神經(jīng)毒素進行定向設(shè)計改造成鈉離子通道靶向藥物用于臨床疾病的治療。此外，來源于七鰓鰻口腔腺的富含半胱氨酸分泌蛋白(Cysteine-rich buccal gland protein，CRBGP) 也首次被證明能夠抑制海馬神經(jīng)元和背根神經(jīng)元的鈉離子電流。以下針對鈉離子通道疾病及其抑制劑生物學(xué)功能的最新研究進展進行分析歸納。

電壓門控型鈉離子通道，鈉離子通道疾病，鈉離子通道抑制劑，神經(jīng)毒素，富含半胱氨酸分泌蛋白質(zhì)，七鰓鰻

細胞電活動是生命現(xiàn)象的基本特征之一，離子通道是其結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。多種神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病，如癲癇、腦溢血、神經(jīng)痛、進行性心臟傳導(dǎo)缺陷和原發(fā)性心室纖顫等都與鈉離子通道氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。Colombo等報道持續(xù)的鈉離子電流是這些疾病產(chǎn)生的主要原因。由于鈉離子通道抑制劑能夠阻斷鈉離子電流，因此臨床上多利用其治療因鈉離子通道異常放電而引起的疾病。本文即對鈉離子通道的結(jié)構(gòu)、相關(guān)疾病、抑制劑及其應(yīng)用進行了歸納分析。

1 鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能

鈉離子通道基因家族包含11個成員 (Voltage-gated sodium channel α-subunit genes?)，可編碼10種不同的鈉離子通道 (Nav1.1?Nav1.9和Nax)。鈉離子通道是一種跨膜糖蛋白，主要由形成離子孔道的α-亞基 (α-subunit，240?260 kDa) 和一個或幾個輔助性β-亞基 (β-subunit，33?36 kDa) 構(gòu)成 (圖1)。α-亞基含有4個同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (DomainⅠ? Domain Ⅳ, DI?DIV)，且每個結(jié)構(gòu)域都包含6個螺旋跨膜片段 (Segments 1?6，S1?S6)。這6個跨膜片段可根據(jù)功能的不同被分成兩類：S1?S4為電壓傳感器；S5和S6可形成選擇性運輸鈉離子的孔道。單獨的 α-亞基本身就具有鈉離子通道的功能。β-亞基 (β1?β4) 為單次跨膜蛋白，可通過調(diào)節(jié)細胞表面鈉離子通道的表達，從而改變鈉離子通道的密度和細胞的興奮性。此外，β-亞基還能調(diào)節(jié)胞內(nèi) α-亞基的運輸和細胞的粘附等。2011年P(guān)ayandeh等報道了布氏弓形菌的鈉離子通道的晶體結(jié)構(gòu)。他們根據(jù)得到的鈉離子通道晶體結(jié)構(gòu)推測鈉離子通道的運作機制是：鈉離子通道被激活時，細胞發(fā)生去極化，細胞膜兩側(cè)的電場發(fā)生改變，從而導(dǎo)致DI?DIII中帶有正電荷的電壓感受器S4迅速向外移動。然后，向外移動的S4與S4?S5間的連接器 (Linker) (圖2)作為一個結(jié)構(gòu)單位將S5?S6向外推。在這期間，S5?S6始終保持一個緊密的耦合結(jié)構(gòu)，這就迫使S5?S6及其周圍的亞基移動，最終導(dǎo)致孔道打開。鈉離子通道在開放后的數(shù)毫秒內(nèi)就會發(fā)生失活，這主要是由于DIV電壓感受器運動變慢最終導(dǎo)致鈉離子通道的關(guān)閉。鈉離子通道的電子密度圖結(jié)果顯示：當通道處于關(guān)閉狀態(tài)時，S6疊加于孔道周圍處于閉合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)上。通常，鈉離子通道會保持在一個失活的狀態(tài)直至細胞膜電位再次發(fā)生去極化。

鈉離子通道的主要功能是調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，其分布、密度、運輸、激活閾值以及重新激活等固有屬性能夠在很大程度上影響神經(jīng)元的電活動。此外，電生理實驗結(jié)果表明鈉離子通道在痛覺的產(chǎn)生及傳遞過程中發(fā)揮重要作用。近年來，Vastani 等深入研究了鈉離子通道在慢性疼痛和神經(jīng)疼痛等方面的作用，并指出在采用局部麻醉和神經(jīng)電調(diào)節(jié)技術(shù)治療疼痛時，電壓門控型鈉離子通道的構(gòu)象是影響其療效的一個重要因素。因此，臨床上現(xiàn)多利用鈉離子通道抑制劑通過阻滯持續(xù)的鈉離子電流從而抑制神經(jīng)元的電興奮性，最終達到鎮(zhèn)痛的 目的。

圖2 布氏弓形菌Arcobacter butzleri電壓門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)要素[3]

2 鈉離子通道疾病 (Sodium Chan- nelopathies)

編碼鈉離子通道α-和β-亞基的基因發(fā)生突變后，鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和生物物理屬性會受到影響，最終形成鈉離子通道疾病。鈉離子通道疾病可根據(jù)其涉及的器官被分為4種類型：外周神經(jīng)鈉離子通道疾病 (Peripheral Nerve Sodium Channelopathies)、腦鈉離子通道疾病 (Brain Sodium Channelopathies)、骨骼肌鈉離子通道疾病(Skeletal Muscle Sodium Channelopathies)、 心臟鈉離子通道疾病 (Cardiac Sodium Channelopathies)。

2.1 外周神經(jīng)鈉離子通道疾病

外周神經(jīng)鈉離子通道疾病主要是外周神經(jīng)疼痛綜合癥，包括神經(jīng)疼痛和炎性疼痛。典型的病例有糖尿病神經(jīng)病變、幻肢痛、脊髓損傷疼痛等。其發(fā)病機制是神經(jīng)受到損傷后，鈉離子通道的運輸、基因表達，以及動力學(xué)等方面會受到影響，最終導(dǎo)致與神經(jīng)性疼痛有關(guān)的神經(jīng)膜重塑和神經(jīng)元超興奮性的發(fā)生。由于Nav1.7 (基因是)、Nav1.8 (基因是) 和Nav1.9 (基因是) 主要表達于外周神經(jīng)元和背根神經(jīng)元，且對神經(jīng)疼痛的發(fā)生起著非常重要的作用，因此這些通道尤其Nav1.7被認為是外周神經(jīng)疼痛綜合癥的止痛靶點。近年來，陸續(xù)有研究報道編碼Nav1.7的基因與繼承紅斑性肢痛病、陣發(fā)性劇痛癥和先天性無痛癥的發(fā)病密切相關(guān)。此外，Nav1.8也被證實在關(guān)節(jié)疼痛和其他疼痛綜合癥中發(fā)揮重要作用。1999年 Porreca 等通過體內(nèi)注射Nav1.8的反義寡核苷酸從而減弱大鼠的神經(jīng)疼痛。此外，小鼠敲除基因后，可明顯表現(xiàn)出對疼痛刺激不敏感。因此，通過抑制Nav1.7、Nav1.8或Nav1.9，從而降低神經(jīng)元超興奮性的發(fā)生，可最終抑制外周神經(jīng)疼痛的產(chǎn)生。

2.2 腦鈉離子通道疾病

腦鈉離子通道疾病是編碼鈉離子通道的(Nav1.1)、(Nav1.2)、(Nav1.3) 或基因 (Nav1.6) 發(fā)生突變所致。其中在大多數(shù)的腦部神經(jīng)元中表達，且最易發(fā)生突變。2002年Lossin等報道：基因的突變會誘發(fā)癲癇。這主要是由于突變后，鈉離子通道的失活受阻，導(dǎo)致持續(xù)的鈉離子內(nèi)流和神經(jīng)元膜發(fā)生持續(xù)的去極化，從而使神經(jīng)元的興奮性增強，最終引發(fā)癲癇。近年來，Liao 等研究發(fā)現(xiàn)突變后，鈉離子通道的門控等特性可發(fā)生顯著性的變化，如持續(xù)性鈉離子電流的增強、失活鈉離子通道的加速復(fù)蘇，以及電壓依賴型鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活的改變等。2008年，Holland等首次證實癲癇病人的發(fā)生突變。盡管電生理實驗結(jié)果表明的突變可引起鈉離子電流的增強，但是其具體的致病機理仍在討論中。2006年Levin等敲除大鼠浦肯野神經(jīng)元和顆粒細胞中的后，大鼠表現(xiàn)為共濟失調(diào)。人類發(fā)生移碼突變后，可引起鈉離子通道DIV結(jié)構(gòu)域縮短，導(dǎo)致鈉離子通道失去功能，最終表現(xiàn)為共濟失調(diào)。

2.3 骨骼肌鈉離子通道疾病

Nav1.4能通過產(chǎn)生和傳播動作電位而引起肌肉收縮，其編碼基因發(fā)生突變后可導(dǎo)致骨骼肌鈉離子通道疾病。目前已發(fā)現(xiàn)高鉀型周期性麻痹、低鉀型周期性麻痹、先天強直肌性肌痙攣、鉀加重肌強直和先天性肌無力綜合癥，這5種遺傳性骨骼肌鈉離子通道疾病均與Nav1.4的突變有關(guān)。幾乎所有的突變都與3個堿基對的異常缺失相關(guān)。1993年Lerche 通過電生理實驗檢測肌強直病人的肌肉樣本發(fā)現(xiàn)：突變后，其編碼的鈉離子通道在開放后可快速失活，并在通道開放后期向內(nèi)增加了穩(wěn)定的電流、從而導(dǎo)致肌肉持續(xù)的去極化和肌肉纖維興奮過度，最終形成肌強直、肌無力綜合癥以及癱瘓等疾病。

2.4 心臟鈉離子通道疾病

心臟鈉離子通道疾病主要是由(Nav1.5) 和(Nav1.8) 基因發(fā)生突變所致。突變后會改變心臟亞型鈉離子通道Nav1.5 α-亞基的功能，能夠通過破壞鈉離子通道的快速失活，從而導(dǎo)致心律失常。與突變相關(guān)的疾病主要有進行性心臟傳導(dǎo)疾病、竇房結(jié)功能障礙、心房停滯以及擴張性心肌病等，且這些疾病具有心源性猝死的風險。近年來，F(xiàn)acer等研究發(fā)現(xiàn)能夠在心室中調(diào)節(jié)心律，其突變后會發(fā)生遺傳性變異并導(dǎo)致心律失常。與突變相關(guān)的疾病主要有心肌梗死、心室纖維性顫動等。

3 鈉離子通道抑制劑

近年來，大量文獻報道自然界中的某些天然小分子化合物類神經(jīng)毒素和多肽類神經(jīng)毒素等能夠通過抑制鈉離子電流從而阻滯神經(jīng)傳導(dǎo)。因此，越來越多的醫(yī)藥研發(fā)公司將這些天然的鈉離子通道抑制劑研制成靶向鈉離子通道藥物用于臨床疾病的治療。

3.1 化合物類神經(jīng)毒素及其化學(xué)合成藥物

河豚毒素 (Tetrodotoxin，TTX) 和石房蛤毒素 (Saxitoxin, STX) 是兩個研究較為深入的化合物類神經(jīng)毒素，分子式分別為CHNO和CHNO，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。TTX和STX的毒性都很強，人誤食后首先是感覺神經(jīng)麻痹，繼而是運動神經(jīng)麻痹，最終導(dǎo)致肢體無力甚至不能運動。這主要是由于二者都是鈉離子通道抑制劑，能夠與鈉離子通道上神經(jīng)毒素結(jié)合位點1 (位于DI?DIV中S5和S6之間形成的環(huán) 上) 發(fā)生特異結(jié)合，從而抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致肢體麻痹。因此，TTX和STX常作為潛在的鎮(zhèn)痛藥物和局部麻醉劑而被廣泛研究。

臨床研究結(jié)果表明TTX的鎮(zhèn)痛效果是嗎啡的3 200倍；局部麻醉作用是鹽酸普魯卡因的 4 000倍。在加拿大，利用TTX (配方名為Tecti) 對慢性癌癥患者進行鎮(zhèn)痛治療的研究已經(jīng)進入三期臨床試驗階段，其中皮下注射TTX的濃度為15 μg/mL。早在1975年Southcott 就已經(jīng)證明了STX能長時間的抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，其局部麻醉作用是普魯卡因的10萬倍。不過，TTX和STX的毒性都較大，超過一定劑量會產(chǎn)生毒副作用。2011年，Berde等將Tectin與市售丁哌卡因 (濃度為0.25%) 和腎上腺素 (濃度為 5 μg/mL) 聯(lián)合使用后，局部麻醉的持續(xù)時間可延長。因此，單次注射藥物就能長期緩解疼痛，最終減少患者術(shù)后對上癮性藥物如阿片類藥物的需求。2013年Sahadev 等也將STX和糖皮質(zhì)激素地塞米松一同包裹到脂質(zhì)體中，經(jīng)皮下注射到因坐骨神經(jīng)損傷而導(dǎo)致機械性疼痛的大鼠體內(nèi)。試驗結(jié)果顯示單次注射脂質(zhì)體后，大鼠的熱痛覺阻滯時間持續(xù)了(6.9±1.2) d；若在大鼠損傷后的第0、5和12天時分別注射脂質(zhì)體，其阻滯時間可持續(xù)到(18.1±3.4) d。因此，將TTX或STX與其他麻醉性鎮(zhèn)痛藥物 (嗎啡、可卡因、丁哌卡因、地塞米松等) 聯(lián)合應(yīng)用后，不僅鎮(zhèn)痛持續(xù)時間延長，還能因降低劑量而降低毒副作用。

圖3 河豚毒素 (A) 和石房蛤毒素 (B) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

市場上流通的某些局部麻醉劑和鎮(zhèn)痛藥物是含有與河豚毒素和石房蛤毒素類似的芳香基團的胺類化合物。目前最普遍使用的有利多卡因 (CHNO) 等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4A所示。它能夠在濃度很低的情況下抑制或減輕疼痛，對神經(jīng)疼痛的治療有很好的效果。利多卡因能與鈉離子通道的局部麻醉劑結(jié)合位點 (位于DIV S6上的Phe和Tyr) 發(fā)生結(jié)合，通過抑制DIII和DIV結(jié)構(gòu)域中S4的運動從而阻止門控電荷的流入。電生理實驗結(jié)果表明，當鈉離子通道與利多卡因結(jié)合時，其門控電荷減少了38%左右。此外，利多卡因還廣泛應(yīng)用于治療其他鈉離子通道疾病，如疼痛和癲癇等。

陽離子利多卡因衍生物QX-314 (CHNO) 是鈉離子通道抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4B所示。在細胞外時，QX-314的鈉離子通道調(diào)控活性較弱；而在細胞內(nèi)時，其活性較強。2007年Binshtok 等研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用QX-314/辣椒素后表達有Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) 的外周神經(jīng)元上的TRPV1通道被打開，從而導(dǎo)致QX-314進入到外周神經(jīng)元胞體內(nèi)持久的抑制鈉離子電 流。2012年Shen 等研究發(fā)現(xiàn)：大鼠經(jīng)慢性壓迫性神經(jīng)損傷后可誘發(fā)神經(jīng)疼痛。經(jīng)QX-314/辣椒素注射后，其神經(jīng)性疼痛和痛覺過敏的癥狀能被有效的緩解。最新臨床研究結(jié)果表明聯(lián)合使用辣椒素和QX-314這2種藥物可較顯著地抑制患者的疼痛反應(yīng)。

A-803467 (CHCLNO) 是Nav1.8的選擇性抑制劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4C所示，其在緩解機械疼痛、炎性熱痛和神經(jīng)性痛等方面具有明顯的功效。2008年，McGaraughty等通過測痛儀檢測了A-803467對產(chǎn)生慢性疼痛大鼠的疼痛行為的影響。實驗結(jié)果顯示，大鼠的機械觸刺激誘發(fā)痛癥狀明顯減少，這就強有力地證明了A-803467作為鈉離子通道抑制劑具有鎮(zhèn)痛的功能。隨后，Abbott實驗室對A-803467進行了改造。改造后的A-803467對神經(jīng)痛動物模型具有鎮(zhèn)痛作用，且比臨床上常用的鈉離子通道抑制劑藥物美西律和拉莫三嗪更安全有效。

圖4 化學(xué)合成藥物利多卡因 (A) QX-314 (B) 和A-803467 (C) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3.2 多肽類神經(jīng)毒素及其藥物制劑

多肽類神經(jīng)毒素是由某些動物分泌的對神經(jīng)組織具有毒性的內(nèi)毒素，能夠麻痹“食物”或天敵以達到捕食或防御的目的。通常這類毒素能夠與離子通道相應(yīng)的位點結(jié)合，通過阻塞通道孔隙或改變門控從而抑制細胞的活動。這些多肽類神經(jīng)毒素有其典型的特征：都是分子量相對較小的多肽、一級結(jié)構(gòu)中都含有非常保守的半胱氨酸殘基，且形成了對多肽空間結(jié)構(gòu)非常重要的二硫鍵。目前研究較為深入的多肽類神經(jīng)毒素主要有芋螺毒素 (Conotoxins) 和蜘蛛毒素等。

3.2.1 芋螺毒素

芋螺捕食時會釋放毒液到被捕食者體內(nèi)使其麻痹不能運動。芋螺毒素就是毒液中的一些富含二硫鍵的小環(huán)肽，其作用靶點為離子通道。迄今為止，已有4種芋螺毒素超家族成員 (μ-、μO-、δ-、和?-conotoxins) 被確定是以鈉離子通道為靶點，其中μ-Conotoxins和μO-conotoxins為鈉離子通道抑制劑。芋螺毒素具有非常廣泛的藥理學(xué)功效，在治療鎮(zhèn)痛和癲癇等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

μ-Conotoxins家族成員由16?26個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸。到目前為止，已有文獻報道多種μ-Conotoxins具有鈉離子通道抑制劑活性，能夠抑制與疼痛有關(guān)的鈉離子通道亞型Nav.1.3、Nav1.7和Nav.1.8 (表1)。1998年，Shon等在μ-Conotoxins家族中首次發(fā)現(xiàn)了具有鈉離子通道抑制劑屬性的PIIIA (來源于紫金芋螺，)。電生理實驗結(jié)果表明它能夠抑制北美豹蛙表皮肌肉細胞和Wistar大鼠外周神經(jīng)元中的鈉離子電流。2007年，Lewis 等研究發(fā)現(xiàn)TIIIA (來源于郁金香芋螺，) 和GIIIA (來源于地紋芋螺，) 對大鼠背根神經(jīng)元中的河豚毒素敏感型 (TTX-S) 和不敏感型 (TTX-R) 鈉離子通道均具有阻斷作用。2011年Wilson等指出KIIIA (來源于木下芋螺，)、SIIIA (來源于細線芋螺，)、SmIIIA (來源于飛蠅芋螺，)、CIIIA (來源于貓芋螺，)、MIIIA (來源于僧袍芋螺，) 和CnIIIA/B (來源于聳肩芋螺，) 均能夠有效抑制北美豹蛙背根神經(jīng)元中TTX-R型鈉離子通道中的電流。其中，小鼠炎性疼痛試驗結(jié)果顯示KIIIA和SIIIA具有鎮(zhèn)痛功能，且SIIIA已進入臨床前研究階段，商業(yè)名稱為PEG-SIIIA。序列分析結(jié)果顯示KIIIA的 N-末端序列比其他多肽少了1?4個氨基酸殘基 (表1)，這意味著μ-Conotoxins 家族成員C-末端的結(jié)構(gòu)對其與鈉離子通道的結(jié)合較為重要?，F(xiàn)已有越來越多的研究團隊關(guān)注于去除N-末端殘基后的μ-Conotoxins的藥效。此外，2012年Schroeder等在SIIIA和SIIIB的N-末端添加了一些氨基酸殘基。電生理實驗結(jié)果表明：改造前的SIIIA和SIIIB對Nav1.4 (骨骼肌鈉離子通道亞型) 的抑制作用優(yōu)先于Nav1.2 (神經(jīng)元鈉離子通道亞型)；改造后是對Nav1.2的抑制作用優(yōu)先于Nav1.4。因此，芋螺毒素的C-末端是其與鈉離子通道結(jié)合的部位，而N-末端則能選擇其作用鈉離子通道的類型。

表1 μ-芋螺毒素鈉離子通道抑制劑

N.D.: not determined. The cysteins that form disulfide bridges are bold and marked with different underlines.

μO-conotoxins家族成員由28?32個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸。到目前為止，已有5種μO-conotoxins (MrVIA、MrVIB、MfVIA、LtVIA和LtVIC) 被確定是鈉離子通道抑制劑 (表2)。來源于大理石芋螺的MrVIA和MrVIB有很高的同源性，它們對TTX-R型鈉離子通道 (Nav1.8) 的抑制作用高于TTX-S型。因此，MrVIA和MrVIB在很多動物疼痛模型中表現(xiàn)出了良好的鎮(zhèn)痛活性。對于觸誘發(fā)痛和痛覺過敏，鞘內(nèi)注射MrVIB的鎮(zhèn)痛效果是利多卡因的30倍，且副作用很小。MrVIB現(xiàn)已進入臨床前研究階段，其商業(yè)名稱為CGX-1002。來源于美華芋螺的MfVIA與MrVIB的序列同源性最高，其對大鼠背根神經(jīng)元中的TTX-R型和TTX-S型鈉離子通道都具有阻斷作用，其中優(yōu)先抑制Nav1.8和Nav1.4。2007?2008年，Wang 等分別對LtVIA和LtVIC (來源于字碼芋螺，) 做了全細胞膜片鉗實驗，結(jié)果表明它們都能夠抑制大鼠背根神經(jīng)元中鈉離子電流。

表2 μO-芋螺毒素鈉離子通道抑制劑

N.D.: not determined. The cysteins that form disulfide bridges are bold and marked with different underlines.

3.2.2 蜘蛛毒素

蜘蛛在捕食或御敵時其毒腺能夠通過分泌蜘蛛毒素從而將獵物或天敵麻痹甚至殺死。這主要是由于蜘蛛毒素中含有多種分子量較小、且富含二硫鍵的多肽類神經(jīng)毒素，其可影響神經(jīng)元中離子通道的正?；顒?，包括鈉離子通道、鉀離子通道和鈣離子通道等。這些神經(jīng)毒素在醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)很重要的地位，其中部分毒素已于臨床上用于緩解疼痛或治療心律失常等疾病。

據(jù)文獻統(tǒng)計，有近總數(shù)1/3的蜘蛛毒素其作用靶點是鈉離子通道。根據(jù)一級結(jié)構(gòu)和二硫鍵結(jié)構(gòu)的差異，這些蜘蛛毒素可被劃分為12個不同的家族：NaSpTx family 1?NaSpTx family 12 (Spider toxins that target Nachannel family)，其中NaSpTx family 1?3、NaSpTx family 5和NaSpTx family 7?9家族中有些成員具有鈉離子通道抑制劑的屬性 (表3)。各個NaSpTx family家族成員都含有1個由二硫鍵構(gòu)成的抑制劑半胱氨酸結(jié)模體 (Inhibitor cystine knot, ICK)。它能夠保證蜘蛛毒素在成人血清中處于穩(wěn)定狀態(tài)，并持續(xù)數(shù)日。已有研究報道該抑制劑半胱氨酸結(jié)模體在胃液中的半衰期可長達12個多小時。到目前為止，已有多種藥物以其為核心進行定向設(shè)計改造，如止痛藥齊考諾肽 (Prialt)等。此外，部分具有鈉離子通道調(diào)控功能的蜘蛛毒素也因其能夠有效緩解疼痛而受到廣泛的關(guān)注。

NaSpTx family 1家族成員通常來自于捕鳥蛛科Theraphosidae蜘蛛的毒液，由33?35個氨基酸組成。其中，來自虎紋捕鳥蛛毒液的μ/ωTRTX-Hh1a (Huwentoxin-1) 能夠抑制大鼠海馬神經(jīng)元和美洲大蠊背側(cè)不成對中間神經(jīng)元中的鈉離子電流；且μ/ωTRTX-Hh1a經(jīng)鞘內(nèi)注射后對由福爾馬林誘發(fā)的大鼠疼痛模型起到了鎮(zhèn)痛的作用。2006年Bosmans 等從塔蘭圖拉毒蛛的毒液中分離純化出1種多肽類神經(jīng)毒素β-TRTX-Ps1a (Phrixotoxin-3)。電生理實驗結(jié)果顯示β-TRTX-Ps1a對非洲爪蟾卵母細胞上多種類型的鈉離子通道均有抑制作用，如Nav1.1、Nav1.2、Nav1.4和Nav1.5通道。此外，來自于虎紋捕鳥蛛的μ-TRTX-Hh2a (Huwentoxin-4) 和來自于海南捕鳥蛛的μ-TRTX-Hhn1b (Hainantoxin-IV) 均能夠抑制大鼠背根神經(jīng)元中的TTX-S型鈉離子電流。其中，μ-TRTX-Hh2a是通過與鈉離子通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點4 (位于DII中S1?S2之間和S3?S4之間形成的胞外連接環(huán)上) 發(fā)生結(jié)合從而阻斷TTX-S型鈉離子通道；而μ-TRTX-Hhn1b則是通過作用于結(jié)合位點1發(fā)揮作用。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果我們不難看出NaSpTx family 1的這4個成員大多能選擇性地抑制TTX-S型鈉離子通道，對其功能的深入研究不僅可為今后篩選具有較高藥效的鎮(zhèn)痛藥物奠定基礎(chǔ)，還為深入研究鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能提供必要的理論支持。

NaSpTx family 2家族成員主要來自于捕鳥蛛科Theraphosidae蜘蛛的毒液，由33?41個氨基酸組成。其中，來自金屬紅尾蛛毒液的β/ω-TRTX-Tp1a (Protoxin Ⅰ) 能夠抑制人胚腎細胞 (HEK293) 中的Nav1.7電流。到目前為止，Middleton和Priest等認為β/ω-TRTX-Tp1a是Nav1.7通道最為有效的抑制劑之一，極具成藥前景。2006年，Bosmans等從塔蘭圖拉毒蛛的毒液中分離純化出另1種多肽類神經(jīng)毒素β-TRTX-Cm2a (Ceratotoxin-3)。電生理實驗結(jié)果表明其能夠阻斷非洲爪蟾卵母細胞上的Nav1.5和Nav1.8通道。不過，β-TRTX-Cm2a對Nav1.8的抑制作用較弱。2 μmol/L的β-TRTX-Cm2a才能夠減少Nav1.8通道中45%的電流。此外，來自敬釗纓毛蛛毒液的μ-TRTX-Cj1a (Jingzhaotoxin-34) 能夠阻斷大鼠背根神經(jīng)元中的TTX-S型鈉離子通道。到目前為止，NaSpTx family 2家族所報道的這3個成員都夠能抑制傳播疼痛信號的鈉離子通道亞型 (Nav1.7或Nav1.8)。不過，這些具有潛在鎮(zhèn)痛功能的蜘蛛毒素能否進一步應(yīng)用于臨床還有待于后續(xù)的動物學(xué)實驗及臨床前研究。

NaSpTx family 3 家族成員通常來自于不同屬的狼蛛毒液，由29?32個氨基酸組成。來自金屬紅尾毒液的β/ω-TRTX-Tp2a (Protoxin Ⅱ) 和智利紅玫瑰毛蜘蛛毒液的β-TRTX-Gr1b (GsAF Ⅰ) 都對Nav1.7通道具有抑制作用。其中，β/ω-TRTX-Tp2a抑制人胚腎細胞鈉離子電流的IC僅為0.3 nmol/L。這也是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最為有效的Nav1.7通道抑制劑之一，具有非常廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。目前，NaSpTx family 3家族的這2個成員均是選擇性地作用于Nav1.7通道，這也為今后研制成Nav1.7通道的特異性鎮(zhèn)痛藥物 (Nav1.7-selective analgesics) 奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

NaSpTx family 5家族到目前為止只有2個成員，均來自于粒突蛛屬蜘蛛的毒液,分別由28和29個氨基酸組成。2007年，Corzo等發(fā)現(xiàn)，來自于巨型上戶蛛毒液的β-HXTX-Mg1a (Magi-5) 能夠通過作用于非洲爪蟾卵母細胞上Nav1.2通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點4而使Nav1.2中的電流發(fā)生減少 (<15%)。不過目前我們對于該家族的了解還是很少，亟待于進一步的研究證明。

NaSpTx family 7家族成員主要是從捕鳥蛛科Theraphosid蜘蛛的毒液中分離純化出來的，由33?36個氨基酸構(gòu)成。Xiao和Rong 等發(fā)現(xiàn)來自于敬釗纓毛蛛毒液中的 ＆-TRTX-Cj1a (Jingzhaotoxin-1) 和β/k -TRTX-Cj1a (Jingzhaotoxin-3) 均能夠作用于Nav1.5通道。其中，Xiao等認為＆-TRTX-Cj1a是通過與鈉離子通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點3 (位于DIV中S3和S4之間形成的胞外連接環(huán)上) 發(fā)生結(jié)合從而抑制大鼠背根神經(jīng)元中Nav1.5的電流；而β/k-TRTX-Cj1a則是通過作用于結(jié)合位點4從而抑制人胚腎細胞中Nav1.5的電流。不過，現(xiàn)已報道的NaSpTx family 7家族成員大多是作為鉀離子通道的抑制劑而被廣泛研究，只有上述2個成員被發(fā)現(xiàn)具有鈉離子通道調(diào)控功能。

目前，Rodríguez de la Vega等在NaSpTx family 8家族中發(fā)現(xiàn)3個成員：μ-CNTX-Pn1a (PhTx1)、U-CNTX-Pk1a (PKTx1A) 和U-CNTX-Pk1b (PKTx1B)，分別由79、78和78個氨基酸組成，均來自于櫛足蛛科Ctenid蜘蛛的毒液。通常，NaSpTx family家族成員只含有3對二硫鍵，而NaSpTx family 8家族成員卻包含7對二硫鍵 (表3)。2006年，Martin-Moutot 等人從香蕉塔蘭圖拉毒蛛的毒液中分離純化出μ-CNTX-Pn1a (PhTx1)，并發(fā)現(xiàn)其能夠通過與鈉離子通道上的神經(jīng)毒素結(jié)合位點1結(jié)合從而抑制中國倉鼠卵巢細胞中Nav1.2的電流。此外，序列分析結(jié)果顯示NaSpTx family 8家族的這3個成員氨基酸序列高度一致，因此推測其可能具有相同的藥理學(xué)性質(zhì)。

NaSpTx family 9家族目前只有2個成員被報道，均來自于毛蟹蛛屬蜘蛛的毒液。它們分別是μ-TMTX-Hme1a (Hm-1) 和μ-TMTX-Hme1b (Hm-2)，由37和40個氨基酸組成。μ-TMTX-Hme1a和μ-TMTX-Hme1b都能夠抑制非洲爪蟾卵母細胞的Nav1.2、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.6通道，其中μ-TMTX-Hme1b對Nav1.5通道的抑制作用及其微弱。

據(jù)保守估計蜘蛛毒液中至少含有1 000多萬種具有生物活性的多肽。但是，目前文獻報道的具有離子通道調(diào)控功能的多肽也僅為0.01%左右，還有很多組分尚未被分離及鑒定。因此，蜘蛛毒液中還有很多新的蜘蛛毒素亟待被發(fā)現(xiàn)、定性和研究，這將為今后鎮(zhèn)痛、局麻藥物的開發(fā)利用起到極大的推進作用。

表3 蜘蛛毒素鈉離子通道抑制劑

N.D.: not determined. The cysteins that form disulfide bridges are bold and marked with different underlines.

3.3 七鰓鰻口腔腺富含半胱氨酸分泌蛋白

富含半胱氨酸分泌蛋白 (Cysteine-rich secretory protein，CRISP) 家族成員多為單鏈分泌蛋白，分子質(zhì)量在20?30 kDa之間，其一級結(jié)構(gòu)含有多個高度保守的Cys殘基?，F(xiàn)已確認分布于爬行動物毒腺中的CRISP對多種離子通道具有阻斷作用。2009年，Xiao等研究發(fā)現(xiàn)，來源于七鰓鰻口腔腺的富含半胱氨酸分泌蛋白 (cysteine-rich buccal gland protein，Lj-CRBGP) 與蛇毒富含半胱氨酸分泌蛋白中的Ablomin具有較高的同源性 (60%)，且含有16個高度保守的半胱氨酸殘基 (圖5)。此外，電生理實驗結(jié)果表明天然Lj-CRBGP能夠通過阻斷海馬神經(jīng)元和背根神經(jīng)元的鈉離子電流從而減弱神經(jīng)元的興奮性。因此，Xiao等推測水中“吸血鬼”七鰓鰻可能通過其口腔腺中的Lj-CRBGP來抑制宿主魚體的局部疼痛反應(yīng)以保證其能成功地吸附在魚體上吸血食肉。不過，具體機制仍需進一步的動物實驗證明。

圖5 日本七鰓鰻CRBGP氨基酸序列及其各結(jié)構(gòu)域

4 研究前景

到目前為止，研究人員對鈉離子通道的基因、結(jié)構(gòu)和功能等都已進行了較為透徹的研究，并已確定其參與多種疾病的發(fā)病過程。因此，目前臨床上有多種藥物是以鈉離子通道為治療靶點，如人工合成的化合物，自然界中天然存在的神經(jīng)毒素，以及根據(jù)神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)進行定向設(shè)計改造的新型分子。這使它們有望在某些與鈉離子通道相關(guān)的疑難疾病的治療中得到更廣泛的應(yīng)用。近年來，七鰓鰻富含半胱氨酸分泌蛋白被報道具有鈉離子通道阻斷功能以及抑制中性粒細胞遷移功能，對其生物學(xué)功能的深入研究將有助于開發(fā)新型、低毒的消炎鎮(zhèn)痛藥物，具有較高的科學(xué)意義以及應(yīng)用前景。

REFERENCES

[1] Colombo E, Franceschetti S, Avanzini G, et al. Phenytoin inhibits the persistent sodium current in neocortical neurons by modifying its inactivation properties. PLoS ONE, 2013, 8(1): e55329.

[2] Savio-Galimberti E, Gollob MH, Darbar D. Voltage-gated sodium channels: biophysics, pharmacology, and related channelopathies. Front Pharmacol, 2012, 3: 124.

[3] Payandeh J, Scheuer T, Zheng N, et al. The crystal structure of a voltage-gated sodium channel. Nature, 2011, 475(7356): 353–358.

[4] Payandeh J, Gamal El-Din TM, Scheuer T, et al. Crystal structure of a voltage-gated sodium channel in two potentially inactivated states. Nature, 2012, 486(7401): 135?139.

[5] Vastani N, Seifert B, Spahn DR, et al. Preconditioning depolarizing ramp currents enhance the effect of sodium channel blockers in primary sensory afferents. Neuromodulation, 2013, 16(4): 336?344.

[6] Dib-Hajj SD, Binshtok AM, Cummins TR, et al. Voltage-gated sodium channels in pain states: role in pathophysiology and targets for treatment. Brain Res Rev, 2009, 60(1): 65–83.

[7] Schuelert N, McDougall JJ. Involvement of NaV1.8 sodium ion channels in the transduction of mechanical pain in a rodent model of osteoarthritis. Arthritis Res, 2012, 14(1): R5.

[8] Lossin C, Wang DW, Rhodes TH. Molecular basis of an inherited epilepsy. Neuron, 2002, 34(6): 877–884.

[9] Liao Y, Deprez L, Maljevic S, et al. Molecular correlates of age-dependent seizures in an inherited neonatal-infantile epilepsy. Brzin, 2010, 133(Pt 5): 1403?1414.

[10] Levin SI, Khaliq ZM, Aman TK. Impaired motor function and learning in mice with conditional knockout of the Na channel SCN8A (Nav1.6) in cerebellar Purkinje neurons and granule cells. J Neurophysiol, 2006, 96: 785–793.

[11] Michel P, Sternberg D, Jeannet PY, et al. Comparative efficacy of repetitive nerve stimulation, exercise, and cold in differentiating myotonic disorders. Muscle Nerve, 2007, 36(5): 643?650.

[12] Lerche H, Heine R, Pika U. Human sodium channel myotonia: slowed channel inactivation due tosubstitutions for a glycine withinthe Ⅲ-Ⅳ linker. J Physiol, 1993, 470(10): 13–22.

[13] Facer P, Punjabi PP, Abrari A. Localisation of SCN10A gene product Nav1.8 and novel pain-related ion channels in human heart. Int Heart J, 2011, 52(3): 146–152.

[14] Stevens M, Peigneur S, Tytgat J. Neurotoxins and their binding areas on voltage-gated sodium channels. Front Pharmacol, 2011, 2: 71.

[15] Southcott RV. The neurologic effects of noxious marine creatures. Contemp Neurol Ser, 1975, 12: 165?258.

[16] Tardieu F, Reymond M, Hamard P, et al. Spatial distributions of expansion rate, cell division rate and cell size in maize leaves: asynthesis of the effects of soil water status, evaporative demand and temperature. J Exp Bot, 2000, 51(350): 1505?1514.

[17] Berde CB, Athiraman U, Yahalom B, et al. Tetrodotoxin-bupivacaine-epinephrine combinations for prolonged local anesthesia. Mar Drugs, 2011, 9(12): 2717?2728.

[18] Shankarappa SA, Tsui JH, Kim KN, et al. Prolonged nerve blockade delays the onset of neuropathic pain. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(19): 7958.

[19] Sheets MF, Hanck DA. Molecular action of lidocaine on the voltage sensors of sodium channels. J Gen Physiol, 2003, 121(2): 163?175.

[20] Binshtok AM, Bean BP, Woolf CJ. Inhibition of nociceptors by TRPV1-mediated entry of impermeant sodium channel blockers. Nature, 2007, 449(7162): 607–610.

[21] Shen J, Fox LE, Cheng J. Differential effects of peripheral versus central coadministration of QX-314 and capsaicin on neuropathic painin rats. Anesthesiology, 2012, 117(2): 365?380.

[22] McGaraughty S, Chu KL, Scanio MJ, et al. A selective Nav1.8 sodium channel blocker, A-803467[5-(4-chlorophenyl-N-(3,5-dimethoxypheny) furan-2-carboxamide], attenuates spinal neuronal activity in neuropathic rats. Pharmacol Exp Ther, 2008, 324(3): 1204?1211.

[23] Eijkelkamp N, Linley JE, Baker MD, et al. Neurological perspectives on voltage-gated sodium channels. Brain, 2012, 135(9): 2585?2612.

[24] Urbarova I, Karlsen BO, Okkenhaug S, et al. Digital marine bioprospecting: mining new neurotoxin drug candidates from the transcriptomes of. Mar Drugs, 2012, 10(10): 2265?2279.

[25] Cemazar M, Kwon S, Mahatmanto T, et al. Discovery and applications of disulfide-rich cyclic peptides. Curr Top Med Chem, 2012, 12(14): 1534?1545.

[26] Shon KJ, Olivera BM, Watkins M, et al. mu-Conotoxin PIIIA, a new peptide for discriminating among tetrodotoxin-sensitive Nachannel subtypes. J Neurosci, 1998, 18(12): 4473?4481.

[27] Safo P, Rosenbaum T, Shcherbatko A, et al. Distinction among neuronal subtypes of voltage-activated sodium channels by mu-conotoxin PIIIA. J Neurosci, 2000, 20(1): 76?80.

[28] Lewis RJ, Schroeder CI, Ekberg J, et al. Isolation and structure-activity of mu-conotoxin TIIIA, a potent inhibitor of tetrodotoxin-sensitive voltage-gated sodium channels. Mol Pharmacol, 2007, 71(3): 676?685.

[29] Wilson MJ, Yoshikami D, Azam L, et al. μ-Conotoxins that differentially block sodium channels NaV1.1 through 1.8 identify those responsible for action potentials in sciatic nerve. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(25): 10302?10307.

[30] Knapp O, McArthur JR, Adams DJ. Conotoxins targeting neuronal voltage-gated sodium channel subtypes: potential analgesics? Toxins (Basel), 2012, 4(11): 1236?1260.

[31] Ekberg J, Jayamanne A, Vaughan CW, et al. muO-conotoxin MrVIB selectively blocks Nav1.8 sensory neuron specific sodium channels and chronic pain behavior without motor deficits. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(45): 17030?17035.

[32] Vetter I, Dekan Z, Knapp O, et al. Isolation, characterization and total regioselective synthesis of the novel μO-conotoxin MfVIA fromthat targets voltage-gated sodium channels. Biochem Pharmacol, 2012, 84(4): 540?548.

[33] Wang L, Pi C, Liu J, et al. Identification and characterization of a novel O-superfamily conotoxin from. J Pept Sci, 2008, 14(10): 1077?1083.

[34] Pi C, Liu J, Wang L, et al. Soluble expression, purification and functional identification of a disulfide-rich conotoxinderived from. J Biotechnol, 2007, 128(1): 184?193.

[35] Klint JK, Senff S, Rupasinghe DB, et al. Spider-venom peptides that target voltage-gated sodium channels: pharmacological tools and potential therapeutic leads. Toxicon, 2012, 60(4): 478?491.

[36] Wang M, Rong M, Xiao Y, et al. The effects of huwentoxin-Ⅰ on the voltage-gated sodium channels of rat hippocampal and cockroach dorsalunpaired median neurons. Peptides, 2012, 34(1): 19?25.

[37] Chen JQ, Zhang YQ, Dai J, et al. Antinociceptive effects of intrathecally administered huwentoxin-I, a selective N-type calcium channel blocker, in the formalin test in conscious rats. Toxicon, 2005, 45(1): 15?20.

[38] Bosmans F, Rash L, Zhu S, et al. Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes. Mol Pharmacol, 2006, 69(2): 419?429.

[39] Xiao Y, Bingham JP, Zhu W, et al. Tarantula huwentoxin-Ⅳ inhibits neuronal sodium channels by binding to receptor site 4 and trapping the domain ii voltage sensor in the closed configuration. J Biol Chem, 2008, 283(40): 27300?27313.

[40] Li D, Xiao Y, Xu X, et al. Structure-activity relationships of hainantoxin-Ⅳ and structure determination of active and inactive sodium channel blockers. J Biol Chem, 2004, 279(36): 37734?37740.

[41] Schmalhofer WA, Calhoun J, Burrows R, et al. ProTx-Ⅱ a selective inhibitor of Na1.7 sodium channels, blocks action potential propagation in nociceptors. Mol Pharmacol, 2008, 74(5): 1476?1484.

[42] Corzo G, Sabo JK, Bosmans F, et al. Solution structure and alanine scan of a spider toxin that affects the activation of mammalian voltage-gatedsodium channels. J Biol Chem, 2007, 282(7): 4643?4652.

[43] Xiao Y, Tang J, Hu W, et al. Jingzhaotoxin-Ⅰ, a novel spider neurotoxin preferentially inhibiting cardiac sodium channel inactivation. J Biol Chem, 2005, 280(13): 12069?12076.

[44] Rong M, Chen J, Tao H, et al. Molecular basis of the tarantula toxin jingzhaotoxin-Ⅲ (β-TRTX- Cj1α) interacting with voltage sensors in sodium channel subtype Nav1.5. FASEB J, 2011, 25(9): 3177?3185.

[45] Martin-Moutot N, Mansuelle P, Alcaraz G, et al. Phoneutria nigriventer toxin 1: a novel, state-dependent inhibitor of neuronal sodium channels that interacts with micro conotoxin binding sites. Mol Pharmacol, 2006, 69(6): 1931?1937.

[46] Billen B, Vassilevski A, Nikolsky A, et al. Two novel sodium channel inhibitors fromspider venom differentially interacting with mammalian channel's isoforms. Toxicon, 2008, 52(2): 309?317.

[47] Wang YL, Kuo JH, Lee SC, et al. Cobra CRISP functions as an inflammatory modulator via a novel Znand heparan sulfate-dependent transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules. J Biol Chem, 2010, 285(48): 37872?37883.

[48] Xiao R, Pang Y, Li QW. The buccal gland ofis a source of diverse bioactive proteins. Biochimie, 2012, 94(5): 1075?1079.

(本文責編 陳宏宇)

Progress in sodium channelopathies and biological functions of voltage-gated sodium channel blockers

Hongyan Wang, Meng Gou, Rong Xiao, and Qingwei Li

College of Life Science, LiaoningNormalUniversity, Dalian 116081, Liaoning, China

Voltage-gated sodium channels (VGSCs), which are widely distributed in the excitable cells, are the primary mediators of electrical signal amplification and propagation. They play important roles in the excitative conduction of the neurons and cardiac muscle cells. The abnormalities of the structures and functions of VGSCs can change the excitability of the cells, resulting in a variety of diseases such as neuropathic pain, epilepsy and arrhythmia. At present, some voltage-gated sodium channel blockers are used for treating those diseases. In the recent years, several neurotoxins have been purified from the venom of the animals, which could inhibit the current of the voltage-gated sodium channels. Usually, these neurotoxins are compounds or small peptides that have been further designed and modified for targeted drugs of sodium channelopathies in the clinical treatment. In addition, a novel cysteine-rich secretory protein (CRBGP) has been isolated and purified from the buccal gland of the lampreys (), and it could inhibit the Nacurrent of the hippocampus and dorsal root neurons for the first time. In the present study, the progress of the sodium channelopathies and the biological functions of voltage-gated sodium channel blockers are analyzed and summarized.

voltage-gated sodium channel, sodium channelopathies, voltage-gated sodium channel blockers, neurotoxins, cysteine-rich secretory proteins, lampreys

October 8, 2013; Accepted:December 5, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 31301880), China Postdoctoral Science Fundation (No. 2013M541246), New Teacher of Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20112136120002), Scientific Research Fund of Liaoning Provincial Education Department (No. L2011187), Scientific and Technological Research Projects of Dalian (No. 2011J21DW014).

Rong Xiao. Tel: +86-411-85827098; E-mail: xiaorong_lnnu@126.com Qingwei Li. Tel/Fax: +86-411-85827799; E-mail: liqw@263.net

國家自然科學(xué)基金 (No. 31301880)，中國博士后科學(xué)基金第54批面上資助項目 (No. 2013M541246)，高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類資助課題 (No. 20112136120002)，遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目 (No. L2011187)，大連市科學(xué)技術(shù)基金 (No. 2011J21DW014) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-02-17

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130507.html