香菇多糖對5-FU抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制

關(guān)秀文，韋炳鄧，楊軍，杜寒松，張萬里，牛彥鋒Δ

（1.江漢大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，湖北武漢430300；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科，湖北武漢430022）

香菇多糖對5-FU抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制

關(guān)秀文1，韋炳鄧1，楊軍1，杜寒松2，張萬里2，牛彥鋒2Δ

（1.江漢大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，湖北武漢430300；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科，湖北武漢430022）

目的研究香菇多糖對5-FU抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)AGS胃癌細(xì)胞，分為CON組（未加入香菇多糖和5-FU）、LEN組（僅香菇多糖培養(yǎng)）、FNM組（僅5-FU培養(yǎng)）和L＋F組（香菇多糖和5-FU培養(yǎng)），比較4組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、增殖指數(shù)（proliferation index，PI）、凋亡率、多重耐藥基因（multidrug resistance 1，MDR1）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRP）表達(dá)的差異。結(jié)果LEN組和CON組D1～D7吸光值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均顯著高于FNM組和L＋F組吸光值（P＜0.05），且L＋F組細(xì)胞D1～D7的吸光值均顯著低于FNM組（P＜0.05）。CON組和LEN組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期和凋亡率均顯著低于FMN組和L＋F組（P＜0.05），S期和G2／M期均顯著高于FMN組和L＋F組（P＜0.05）；L＋F組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期和凋亡率均顯著高于FNM組（均P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM組（均P＜0.05）。CON組和FNM組AGS胃癌細(xì)胞MDR1和MRP表達(dá)均顯著高于LEN組和L＋F組（P＜0.05）；L＋F組MDR1和MRP表達(dá)均顯著低于LEN組（P＜0.05）。結(jié)論香菇多糖可顯著增強(qiáng)5-FU對AGS細(xì)胞增殖的抑制作用，其作用機(jī)制可能與降低耐藥基因MDR1和MRP表達(dá)有關(guān)。

胃癌；香菇多糖；5-FU；增殖；機(jī)制

香菇多糖是目前廣泛應(yīng)用的化療藥物，為治療腫瘤時的輔助用藥，可顯著提高化療藥物的有效率并降低不良反應(yīng)，但目前對其作用機(jī)制尚未完全明確［1-2］。有研究表明：香菇多糖在體內(nèi)可通過改善T淋巴細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫力而增強(qiáng)化療的療效［3］，體外實驗表明香菇多糖同樣具有抑制腫瘤的作用［4］，因體外實驗缺乏體內(nèi)實驗的免疫環(huán)境，推測可能存在其他作用機(jī)制。本研究采用香菇多糖聯(lián)合5-FU處理AGS胃癌細(xì)胞，分析多重耐藥基因（multidrug resistance 1，MDR1）和（multidrug resistance-associated proteins，MRP）表達(dá)的差異，探討香菇多糖對5-FU抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 AGS人胃癌細(xì)胞購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心；胎牛血清和DMEM購自Hyclone公司；香菇多糖為南京康海藥業(yè)有限公司的香菇多糖凍干粉劑（國藥準(zhǔn)字H10950078）；5-FU購于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 AGS胃癌細(xì)胞完全培養(yǎng)基為10%胎牛血清和90%DMEM，培養(yǎng)條件在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)培養(yǎng)方法分為CON組（僅完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，未加入香菇多糖和5-FU處理）、LEN組（完全培養(yǎng)基及香菇多糖培養(yǎng)，香菇多糖終濃度0.2μmol／L）、FNM組（完全培養(yǎng)基及5-FU培養(yǎng)，5-FU終濃度2μg／m L）和L＋F組（完全培養(yǎng)基、香菇多糖和5-FU培養(yǎng)，香菇多糖終濃度0.2μmol／L，5-FU終濃度2μg／mL）。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法檢測4組AGS胃癌細(xì)胞增殖情況，檢測處理前（D0）和處理D1～D7后的吸光值變化，吸光值＝所測吸光度-空白對照組吸光度。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4 細(xì)胞周期和凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測4組AGS胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖指數(shù)（proliferation index，PI）和凋亡率，其中PI＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 MDR1和MRP表達(dá) 采用Western blot檢測多藥耐藥基因MDR1和MRP表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯影拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Sigma Plot 11.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。4組細(xì)胞均數(shù)間的多重比較采用Student-Newman-Keuls法兩兩比較計算P值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖曲線 4組AGS胃癌細(xì)胞D0吸光值無明顯差異；LEN組和CON組D1～D7的吸光值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均顯著高于FNM組和L＋F組吸光值（P＜0.05）；L＋F組細(xì)胞D1～D7的吸光值顯著低于FNM組（P＜0.05，見圖1）。

圖1 4組AGS胃癌細(xì)胞D0～D7吸光值比較*P＜0.05，與FNM組對比Fig.1 Comparison of D0～D7's OD in AGS gastric cancer cells among four groups *P＜0.05，compared with FNM group

2.2 細(xì)胞周期、PI和凋亡率 CON組和LEN組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期、S期、G2／M期、PI和凋亡率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但G0／G1期和凋亡率均顯著低于FMN組和L＋F組（P＜0.05），S期和G2／M期均顯著高于FMN組和L＋F組（P＜0.05）；L＋F組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期和凋亡率均顯著高于FNM組（P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM組（P＜0.05，見表1）。

表1 4組AGS胃癌細(xì)胞周期、PI和凋亡率比較（%）Tab.1 Comparison of cell cycle，PIand apoptosis rate of AGS gastric cancer cells in four groups（%）

2.3 MDR1和MRP表達(dá) CON組和FNM組AGS胃癌細(xì)胞MDR1和MRP表達(dá)無明顯差異，但均顯著高于LEN組和L＋F組（P＜0.05）；L＋F組MDR1和MRP表達(dá)顯著低于LEN組（P＜0.05，見圖2、圖3）。

圖2 4組細(xì)胞MDR1基因蛋白質(zhì)表達(dá)比較*P＜0.05，與LEN組相比Fig.2 Comparison of MDR1 protein expressions in four groups*P＜0.05，compared with LEN group

圖3 4組細(xì)胞MRP基因蛋白質(zhì)表達(dá)對比*P＜0.05，與LEN組相比Fig.3 Comparison of MRP protein expressions in four groups*P＜0.05，compared with LEN group

3 討論

5-FU是一種S期特異性藥物，通過抑制DNA合成導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，是目前臨床上綜合治療胃癌最常見的化療藥物［5］。臨床研究表明：以5-FU為主體的多藥聯(lián)合化療在治療胃癌后可獲得耐藥性，導(dǎo)致患者病情進(jìn)展從而更換二線化療方案，其產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致有效率下降的作用機(jī)制可能與耐藥基因有關(guān)，目前報道的相關(guān)基因包括MDR1和MRP等［6-7］，這些耐藥基因的表達(dá)增加或激活會導(dǎo)致化療藥物無法產(chǎn)生抗腫瘤作用。MDR1為位于細(xì)胞膜的一種P-糖蛋白，含有2個ATP結(jié)合位點，跨膜區(qū)域構(gòu)成藥物通道盒式結(jié)構(gòu)，利用ATP水解供能將化療藥物泵出胞膜外，導(dǎo)致化療藥物無法與腫瘤細(xì)胞結(jié)合［8-9］；MRP屬于非P跨膜糖蛋白，可將化療藥物分子逆濃度泵出細(xì)胞外，從而降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，同時可改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH值，抑制化療藥物與靶點的結(jié)合，導(dǎo)致化療藥物失去作用［10-11］。體外實驗表明：化療藥物反復(fù)作用于腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致耐藥基因MDR1和P-gp等表達(dá)增加而產(chǎn)生耐藥細(xì)胞株［12-13］，說明抑制耐藥基因的表達(dá)對增加化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖具有重要作用。本研究中，CON組和FNM組胃癌細(xì)胞MDR1和MRP表達(dá)無明顯差異，表明AGS胃癌細(xì)胞存在耐藥基因表達(dá)。

香菇多糖是目前常用的增強(qiáng)化療藥物療效的輔助用藥，可顯著提高化療藥物的有效率并降低其不良反應(yīng)，這與其改善T淋巴細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫力有關(guān)［14-15］。體外實驗表明香菇多糖同樣具有抑制腫瘤的作用，但目前尚無證據(jù)表明香菇多糖自身對腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用，推測其可能存在其他作用機(jī)制。本研究中，香菇多糖單獨處理AGS胃癌細(xì)胞后，MDR1和MRP表達(dá)顯著降低，表明香菇多糖可改善腫瘤細(xì)胞耐藥狀況。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LEN組和CON組D1～D7的吸光值均顯著高于FNM組和L＋F組吸光值（P＜0.05）；L＋F組細(xì)胞D1～D7的吸光值顯著低于L＋F組（P＜0.05）；CON組和LEN組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期和凋亡率均顯著低于FMN組和L＋F組（P＜0.05），S期和G2／M期均顯著高于FMN組和L＋F組（P＜0.05）；L＋F組AGS胃癌細(xì)胞G0／G1期和凋亡率均顯著高于FNM組（P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM組（P＜0.05），本實驗首次發(fā)現(xiàn)香菇多糖可通過改善MDR1和MRP表達(dá)而增強(qiáng)5-FU對AGS胃癌細(xì)胞的抑制作用，為香菇多糖體外抗癌提供了客觀證據(jù)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖能夠顯著抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長，能夠引起S期細(xì)胞周期阻滯，激活ERK1／2磷酸化，認(rèn)為香菇多糖的體外抗腫瘤活性可能與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和激活ERK1／2信號通路有關(guān)［16］。但本研究中CON組和LEN組的增殖曲線、細(xì)胞增殖和凋亡均無明顯差異，與該文獻(xiàn)結(jié)果存在差異，說明香菇多糖自身是否對腫瘤細(xì)胞具有直接的抑制作用尚不能下結(jié)論，有待于進(jìn)一步研究。

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（編校：吳茜）

Effect of lentinan on gastric cancer cell's proliferation inhibited by 5-FU and its possiblemechanism

GUAN Xiu-wen1，WEIBing-deng1，YANG Jun1，DU Han-song2，ZHANGWan-li2，NIU Yan-feng2Δ

（1.Department of General Surgery，The Third Affiliated Hospital of Jianghan University，Wuhan 430300，China；2.Department of General Surgery，Union Hospital，TongjiMedical college，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China）

ObjectiveTo study the effect of lentinan on gastric cancer cell's proliferation inhibited by 5-FU and its possiblemechanism.MethodsGastric cancer AGS cell line were divided into CON group（no lentinan and 5-FU treatment），LEN group（only lentinan treatment），F(xiàn)NM group（only 5-FU treatment）and L＋F group（lentinan and 5-FU treatment）according to their treatmentmethod.The cell proliferation，cell cycle，proliferation index（PI），apoptosis rate and expressions ofMDR1 and MRPwere detected and compared.ResultsThe absorbance of D1～D7，S stage，G2／M stage，expressions of MDR1 and MRP in CON group and LEN group were significantly higher than those in FNM group and L＋F group（P＜0.05）.The absorbance of D1～D7，S stage，G2／M stage，expressions of MDR1 and MRP in L＋F group were significantly lower than those in FNM group（P＜0.05），but the G0／G1 stage and apoptosis rate were higher（P＜0.05）.Conclusion Lentinan could significantly promote inhibition effects of5-FU on AGS gastric cancer cell line through lowering expressions of MDR1 and MRP.

gastric cancer；lentinan；5-FU；proliferation；mechanism

R656.6

A

1005－1678（2014）08－0081－03

湖北省自然科學(xué)基金（2013CFB115）

關(guān)秀文，男，碩士，研究方向：消化道腫瘤診斷與治療，E-mail：329703831＠qq.com；牛彥鋒，通信作者，男，博士，研究方向：胃腸道腫瘤診斷與治療，E-mail：895698990＠qq.com。