殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的工藝優(yōu)化考察

孫玉卿，馮占芹，李志韌，鄭增娟，李志堅，張維芬Δ

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊261053；3.中國人民解放軍第二炮兵中國人民解放軍總醫(yī)院口腔科，北京100088）

殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的工藝優(yōu)化考察

孫玉卿1?，馮占芹2?，李志韌3，鄭增娟2，李志堅2，張維芬2Δ

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊261053；3.中國人民解放軍第二炮兵中國人民解放軍總醫(yī)院口腔科，北京100088）

目的殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的工藝優(yōu)化及特性研究。方法噴霧干燥法制備殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球，并采用L9（34）正交設(shè)計，通過掃描電子顯微術(shù)（scanning electron microscopy，SEM）、傅立葉變化紅外線光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、示差掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）、紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometric，UV）表征微球的理化特性，優(yōu)化微球制備工藝。結(jié)果殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球噴霧干燥的最佳工藝條件：進口溫度為150℃，進料速度為8mL／min，空氣流量為300 L／h，殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精的比例為1∶1∶0.33；掃描電子顯微鏡顯示微球的形態(tài)圓整，表面有少許皺褶，無粘連；紅外結(jié)果表明卵磷脂的羰基與殼聚糖的氨基及β-環(huán)糊精的羥基形成氫鍵；差熱分析結(jié)果表明殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的熱穩(wěn)定性降低；優(yōu)化工藝制得的殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的載藥量、包封率為（5.08±0.18）%和（9.53±0.69）%。結(jié)論根據(jù)上述條件對殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球噴霧干燥工藝優(yōu)化后得到的結(jié)果較滿意，為殼聚糖／卵磷脂／β-環(huán)糊精微球的制備和應(yīng)用提供可行的依據(jù)。

殼聚糖；卵磷脂；β-環(huán)糊精；噴霧干燥；微球

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要特點是大腦皮層萎縮、β淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經(jīng)損傷及神經(jīng)元細(xì)胞死亡等，已成為威脅人類晚年健康的一大隱患［1］。

殼聚糖（chitosan，CTS）是甲殼素脫N-乙?；漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物可降解性、無毒、無免疫原性等優(yōu)點，可作為藥物載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。CTS具有抗氧化和細(xì)胞保護作用［2］，研究報道CTS能通過抑制巨噬細(xì)胞激活來阻止NO及OH自由基的生成，具有緩解AD癥狀的作用［3］。Wilsona等［4］報道CTS作為載體，有利于藥物通過血腦屏障，濃集于靶向區(qū)域，從而促進藥物對AD的治療作用。β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生是AD發(fā)生的一個重要誘因，Khodagholi等［5-6］報道CTS作為載體不僅能夠抑制NT2神經(jīng)元的細(xì)胞毒性而且能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的 β淀粉樣蛋白的形成。Kosicek等［7］指出卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）與AD的發(fā)病機制有密切的關(guān)系，PC是合成神經(jīng)遞質(zhì)“乙酰膽堿”的前體物質(zhì)，能夠被大腦攝取用于信息傳遞［8］，因此PC的缺失是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙最主要的原因之一［9］。β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）不僅能夠提高制劑的生物學(xué)特性而且不影響藥物在肺部的沉積［10］，因此，可作為一種理想的藥物輔料。

本實驗將CTS作為模型藥物的同時兼作載體材料，PC和β-CD作為輔料，優(yōu)化噴霧干燥法制備CTS／PC／β-CD微球的工藝，并對其理化特性進行研究，為進一步開發(fā)CTS／PC／β-CD微球作為治療AD的藥物載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 CTS（脫乙酰度≥85%，山東萊州市海力生物制品有限公司）；卵磷脂（上海艾維特醫(yī)藥科技有限公司）；β-CD（成都市科龍化工試劑廠）；Buchi B-290小型噴霧干燥儀（瑞士步琦有限公司，噴嘴直徑0.7mm）；FTIR Avater-360傅里葉變換紅外光譜儀（上海棱光技術(shù)有限公司）；JCM-6000 NeoScope臺式掃描電鏡（怡星公司）；DSC7020差熱掃描分析儀（北京賽思蒙儀器有限公司）；UV-8000／8000A／8000S雙光束紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 處方工藝篩選 精密稱取PC及β-CD各適量，溶于200mL 1%的CTS乙酸溶液中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，根據(jù)L9（34）正交試驗設(shè)計，控制進口溫度（A）分別為190℃，170℃，150℃，進料速度（B）分別為12mL／min，8mL／min，14mL／min，空氣流量（C）分別為700 L／h，400 L／h，300 L／h，CTS／PC／β-CD比例（D）分別為1∶1∶0.33、2∶1∶0.33、3∶1∶0.67，導(dǎo)入Buchi B-290小型噴霧干燥器，噴霧干燥“一步”制得微球粉末。同法制備PC／β-CD空白微球（PC／β-CD的比例為1∶0.33）。

1.3 微球形態(tài)觀察 稱取少許微球撒于樣品蓋上，噴金，然后在高壓條件下進行成像觀察。

1.4 紅外光譜分析 2mg CTS、PC粉末及最優(yōu)噴霧條件制備的CTS／PC／β-CD微球粉末、PC／β-CD空白微球粉末分別與100mg KBr固體混合壓片，用Avater-360紅外光譜儀測定各樣品的紅外光譜，掃描范圍400～4000 cm-1［11］。

1.5 熱分析 分別將5mg CTS、PC粉末及最優(yōu)噴霧條件制備的CTS／PC／β-CD微球粉末、PC／β-CD空白微球粉末置于Al2O3坩堝中，按實驗條件程序升溫，從40℃開始升溫至600℃，升溫速度為5℃／min，對樣品進行TG-DSC測試。

1.6 載藥量和包封率的測定 分別精密稱取CTS／PC／β-CD微球適量（微球的總質(zhì)量），按照CTS／PL／β-CD的制備比例計算，約相當(dāng)于100mg CTS（微球中包封和未包封的總藥量），研磨，用10mL濃度為0.5mol／L的醋酸溶解后置于1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液1mL，置于10 mL容量瓶中，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，在605 nm波長處分別測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A＝0.0593C＋0.1459（n＝6，r＝0.9998），計算藥物CTS在溶液中的濃度，進而得出CTS在微球中的質(zhì)量（微球中的含藥量），即求得微球的載藥量和包封率［12］。

載藥量（%）＝微球中含藥量／微球的總質(zhì)量×100%

包封率（%）＝微球中含藥量／微球中包封和未包封的總藥量×100%

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗結(jié)果重復(fù)3次，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用±s”表示，正態(tài)計量資料組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正交設(shè)計優(yōu)化制備工藝 采用噴霧干燥法制備的CTS／PC／β-CD微球，隨著藥物／載體比例的增加，微球的載藥量和包封率增加（見表1）。根據(jù)載藥量結(jié)果，極差分析可見，A因素3水平的主次順序為A3→A1→A2；B因素3水平的主次順序為B2→B1→B3；C因素3水平的主次順序為C3→C2→C1；D因素3水平的主次順序為D1→D2→D3。故最優(yōu)噴霧條件為A3B2C3D1，即進口溫度為150℃，進料速度為8mL／min，空氣流量為300 L／h，CTS／PC／β-CD的比例為1∶1∶0.33，進口溫度影響最大，其次是CTS／PC／β-CD比例和空氣流量，進料速度影響最小。

表1 正交設(shè)計優(yōu)化噴霧干燥條件Tab.1 Orthogonal design for the optimization of spray-dried operation conditions

2.2 微球形態(tài) 微球的SEM結(jié)果見圖1，由圖可知，微球都較圓整，表面光滑或有皺褶，微球1、3、4、6間發(fā)生粘連，且微球3、4、6表面有針狀結(jié)晶，可能是未包載的CTS。CTS比例越大，微球（3、4、8）的粒徑越大；空氣流量越大，微球（1、6、8）間越易聚集；進口溫度越高，微球（1、2、3）粒徑越不均一。因此，應(yīng)適當(dāng)降低CTS的比例，降低進口溫度，減小空氣流量。按照正交試驗優(yōu)化的噴霧條件制備的微球粒徑較均一，表面皺褶增加，分散性較好，且無針狀結(jié)晶。

圖1 CTS／PC／β-CD微球的SEM圖片（×5000）Fig.1 SEM of spray-dried CTS／PC／β-CD microspheres（×5000）

2.3 微球紅外光譜分析 微球的紅外圖譜見圖2，β-CD在3400 cm-1處有較強的-OH吸收峰［13］，由圖可知，CTS／PC／β-CD微球在3400 cm-1左右的吸收峰增強，是因為噴霧干燥后β-CD的-OH與CTS的-OH、-NH重疊所致。CTS／PC／β-CD微球在1300～900 cm-1左右吸收峰增強，是因為噴霧干燥后C-H、C-O、P-O等單鍵的伸縮振動和C＝O、P＝O等雙鍵的伸縮振動增加所致，CTS／PC／β-CD微球與CTS、β-CD［13］、PC、CTS／β-CD［13］、PC／β-CD比較，在1084 cm-1處的吸收峰變寬，說明PC的C＝O與CTS的-NH及β-CD的-OH形成了氫鍵。

圖2 紅外圖譜Fig.2 FTIR spectrum

2.4 微球差熱分析 微球的差熱分析結(jié)果見圖3，從圖中可看出，在100℃以下都出現(xiàn)了較小的吸收峰，是因為樣品含有水分，為水分子的揮發(fā)和一些小分子的降解峰；CTS在289℃處出現(xiàn)一個小的放熱峰，339℃處出現(xiàn)一個小的吸熱峰，503℃處出現(xiàn)一個較寬的放熱峰，分別是CTS解鏈、結(jié)晶、降解峰；PC在369℃處出現(xiàn)一個放熱峰，394℃處出現(xiàn)一個吸熱峰，518℃處出現(xiàn)一個較寬的放熱峰，可能分別是PC側(cè)鏈和主鏈的降解峰；PC／β-CD在374℃、375℃、377℃和511℃處分別對應(yīng)的是吸熱峰、放熱峰、吸熱峰、放熱峰，與CTS和PC相比較，總吸熱和放熱峰增加；CTS／PC／β-CD在303℃處出現(xiàn)放熱峰，343℃處出現(xiàn)吸熱峰，481℃處出現(xiàn)放熱峰，分別是微球側(cè)鏈和主鏈的降解峰，與PC／β-CD相比較，總吸熱和放熱峰減少，說明CTS、PC、β-CD間發(fā)生了化學(xué)鍵的結(jié)合，但CTS／PC／β-CD吸熱峰和降解峰的溫度與PC、PC／β-CD相比較降低，說明CTS／PC／β-CD噴霧干燥后不僅形成氫鍵的能力降低，而且結(jié)晶能力也下降，因此，CTS／PC／β-CD微球的熱穩(wěn)定性降低。

圖3 差熱掃描圖譜Fig.3 DSC thermograms

2.5 工藝驗證 最佳噴霧干燥工藝的驗證：按照優(yōu)化的噴霧條件制備3批CTS／PC／β-CD微球，并測定載藥量和包封率，試驗結(jié)果為（5.08±0.18）%和（9.53±0.69）%。結(jié)果證明該噴霧條件，適合CTS／PC／β-CD微球的制備。

3 討論

微球的外觀形態(tài)不僅影響粉末的聚集程度，而且影響其在肺部的分散和沉積［14］。微球的形態(tài)與其噴霧干燥的條件有關(guān)，如微球表面皺褶的形成可能是由于在干燥和降溫過程中CTS／PC／β-CD微球皺縮造成的。Chew等報道［15］表面帶有皺褶的圓形微球比表面光滑的微球具有更高的呼吸分?jǐn)?shù)，這是由于皺褶微球的體表面積較大，增加了藥物與吸收部位的接觸面積，更有利于藥物在肺部的吸收，而且皺褶微球的分散性較少依賴于吸入裝置和吸入氣流，少量的皺褶就可達(dá)到理想的效果［16］。本實驗噴霧干燥法制備的CTS／PC／β-CD微球具有皺褶結(jié)構(gòu)，因此，可作為一種理想的肺部吸入藥物載體。

綜上所述，正交試驗優(yōu)化了噴霧干燥法制備CTS／PC／β-CD微球的噴霧條件，微球的形態(tài)圓整，表面有皺褶且無粘連，可作為肺部吸入藥物的載體；FTIR顯示PC的C＝O與CTS的-NH及β-CD的-OH形成了氫鍵，表明藥物與載體間發(fā)生了化學(xué)鍵的結(jié)合；DSC表明CTS／PC／β-CD微球的熱穩(wěn)定性降低。

本實驗主要從噴霧條件及藥物／載體比例來優(yōu)化制備工藝，并考察了微球的表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、載藥量、包封率等特性，后續(xù)實驗中將重點研究微球的體外釋放、體內(nèi)外降解、生物相容性、細(xì)胞毒性以及體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)和藥物效應(yīng)動力學(xué)的研究，考察CTS／PC／β-CD微球的安全性和有效性，為其工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（編校：王儼儼）

Study on process optim ization of the chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin m icrospheres

SUN Yu-qing1?，F(xiàn)ENG Zhan-qin2?，LIZhi-ren3，ZHENG Zeng-juan2，LIZhi-jian2，ZHANGWei-fen2Δ

（1.Clinical College，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；2.College of Pharmacy，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；3.Department of Stomatology，the General Hospital of the Second Artillery Corps of Chinese PLA，Beijing 100088，China）

ObjectiveTo optimize the preparation technology of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres and investigate their characteristics.MethodsChitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres were prepared by spray drying method optimized by the L9（34）orthogonal test.The physicochemical properties ofmicrospheres were characterized by scanning electron microscopy（SEM），fourier transform infrared spectroscopy（FTIR），differential scanning calorimetry（DSC），and ultraviolet spectrophotometric（UV）.ResultsThe optimum spray drying conditions were as follows：the inlet gas temperature was150℃，the feed flow rate was 8 mL／min，the drying air flow was 300 L／h and the ratio of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin was 1∶1∶0.33.Scanning electron micrograph demonstrated that the microspheres were predominantly spherical with slightly wrinkled.Fourier transform infrared spectroscopy showed that the carbonyl group of phosphatidylcholine formed hydrogen bonds with the amide group of chitosan and the hydroxyl group ofβ-cyclodextrin.Differential thermal analysis displayed that the stability ofmicrospheres decreased.The drug load and encapsulation efficiency of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres prepared by the optimum spray drying conditions were（5.08±0.18）%and（9.53±0.69）%，respectively.Conclusion The satisfied effectwas attained after optimizing the spray drying technology of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres，which provides the feasible basis for the preparation and application.

chitosan；phosphatidylcholine；β-cyclodextrin；spray-drying；microsphere

R944.9

A

1005－1678（2014）08－0176－04

國家科技部星火科技計劃項目（2013GA740103）；山東省自然科學(xué)基金（Y2008F15；ZR2012CM025）；山東省科技攻關(guān)（2012YD18063）；山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖浚↗11LF67）

孫玉卿，女，碩士在讀，研究方向：藥物新劑型與新生物材料，E-mail：sunyuqing2013＠163.com；馮占芹，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：藥物新劑型與新生物材料，E-mail：fzhanqin＠163.com；張維芬，通信作者，女，碩士生導(dǎo)師，博士，教授，研究方向：藥物新劑型與新生物材料，E-mail：zwf2024＠126.com。