細胞色素P450 2E1在尼古丁致神經(jīng)細胞氧化損傷中的作用

黨帥，張紅梅

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽473009；2.山西醫(yī)科大學，山西太原030001）

細胞色素P450 2E1在尼古丁致神經(jīng)細胞氧化損傷中的作用

黨帥1，張紅梅2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽473009；2.山西醫(yī)科大學，山西太原030001）

目的本文擬采用體外實驗，探討腦細胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP 2E1）在尼古丁致神經(jīng)細胞氧化損傷中的可能作用。方法實驗選用IMR-32人神經(jīng)母細胞瘤細胞系，設置對照組，尼古丁小劑量組（0.1 nM）、中劑量組（1 nM）和大劑量組（10 nM），并選用中劑量尼古丁加入不同劑量CYP2E1特異性抑制劑二丙烯基硫醚（diallyl sulfide，DAS）（0.025、0.05、0.075 nM）。尼古丁或尼古丁與二丙烯基硫醚處理細胞48 h。取處理后細胞，分別檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、CYP2E1mRNA和蛋白水平的變化，并對CYP2E1蛋白表達水平與LDH活力、SOD活力、ROS含量進行相關(guān)性分析。結(jié)果與對照組相比，經(jīng)低、中、高劑量尼古丁處理后，IMR-32細胞增殖受抑制，抑制率分別為39%、47%、52%（均P＜0.05）；細胞受到損傷，培養(yǎng)基LDH活力分別升高14%、50%、70%（均P＜0.05）；SOD活力下降至對照組的76%、58%、44%（均P＜0.05）；細胞CYP2E1蛋白表達水平顯著升高至2.19、2.65及2.76倍（均P＜0.05），未見CYP2E1mRNA水平改變；ROS生成量升高48%、65%、136%（均P＜0.05）。與尼古?。? nm）組相比，加入低、中、高劑量抑制劑后，SOD活力升高24%、47%、52%（均P＜0.05）；ROS含量下降至77.8%、57.8%、44.3%（均P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示，CYP2E1含量與LDH活力呈正相關(guān)，與SOD活力呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.740和－0.584，與ROS含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.695（均P＜0.01）。結(jié)論尼古丁處理可抑制IMR-32細胞增殖，誘導腦CYP2E1表達，明顯誘導ROS生成，致神經(jīng)細胞損傷。

尼古?。患毎豍450 2E1；自由基；神經(jīng)細胞

尼古丁，又名煙堿，主要存在于煙草中，是廣泛濫用的物質(zhì)之一。近年來吸煙的危害越來越受到人們重視。大量科學研究證明，吸煙對人體的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等，均產(chǎn)生有害作用，其致病機理正在研究［1］。中國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國和消費國，煙草產(chǎn)量占世界總量的1／3。至2006年末，我國吸煙者達3.5億，占全球吸煙總?cè)藬?shù)的1／3，被動吸煙者5.4億，每年約有100萬人死于吸煙相關(guān)疾病。預計到2020年我國每年有200萬人死于吸煙相關(guān)疾病［2］。IMR-32細胞來源于人神經(jīng)母細胞瘤細胞系，可表達CYP2E1，也用于乙醇和尼古丁的靶位——GABAA受體和煙堿型乙酰膽堿受體的研究［3-4］。本文采用IMR-32細胞系，研究不同濃度的尼古丁對神經(jīng)細胞的氧化損傷與CYP2E1表達水平的影響，探討腦CYP2E1在神經(jīng)細胞氧化損傷中的毒理學作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 尼古丁，DCF-DA，DAS，DMSO，多聚賴氨酸均購于美國sigma公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；抗生素（青霉素＋鏈霉素）購于碧云天生物技術(shù)研究所；MEM培養(yǎng)基，胰酶（含EDTA）購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；量子點超敏熒光試劑盒購于武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司；吐溫-80購于湖北大學化工廠；冰乙酸購于鄭州市化學試劑三廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購于上海市新華化工廠；氯化鈉購于開封市化學試劑二廠。

1.2 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；UV-1601紫外可見分光光度計（日本島津）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；－80℃超低溫冰箱（海爾集團）；激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)（德國Leica）；熒光顯微鏡（日本Olympus）；Real-time PCR Detection System（SLAN，HONGSHI）；ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）。

1.3 實驗方法 實驗選用IMR-32人神經(jīng)母細胞瘤細胞系，設置對照組，尼古丁小劑量組（0.1 nM）、中劑量組（1 nM）和大劑量組（10 nM），并選用中劑量尼古?。? nM）加入不同劑量CYP2E1特異性抑制劑二丙烯基硫醚（0.025，0.05，0.075 nM）。尼古丁或尼古丁與二丙烯基硫醚處理細胞48 h。取處理后細胞，分別檢測LDH、SOD的變化。

ROS：細胞爬片，藥物處理48 h后，用PBS緩沖液洗細胞1次，加入含0.05 nM DCF-DA的無色培養(yǎng)基孵育，體積以能充分蓋住細胞為宜。培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5%CO2培養(yǎng)1.5 h，吸棄負載液，PBS漂洗（3×3min）。在LSCM上，用488 nm激光激發(fā)，發(fā)射波長525 nm，掃描20 s左右待細胞內(nèi)熒光強度平穩(wěn)后，記錄此時熒光值。用不含DCF-DA的細胞作為空白對照，以排除自發(fā)熒光的干擾；以樣品的熒光強度值減去空白值作為絕對熒光強度值，未經(jīng)處理的細胞的絕對熒光強度值記為100%，其余各組熒光強度值與之相比得到各自的相對活性氧強度值。

CYP2E1mRNA：參照ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，反應總體積為20μL，其中樣品RNA 2μL，ReverTra Ace 1μL。42℃反應20min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min，反應產(chǎn)物-20℃保存待用。Real-time PCR擴增反應，反應體系25μL，其中SYBR Green mix 12.5μL，cDNA（5倍稀釋）2.5μL。95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸45 s，40次循環(huán)擴增，以β-actin作內(nèi)參。擴增產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳分離，80V電壓電泳35min，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察有無目標條帶，拍照。運用2-△△CT法分析熒光定量PCR結(jié)果，并對CYP2E1蛋白表達水平與LDH活力、SOD活力、ROS含量進行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，對CYP2E1表達水平與LDH活力、SOD活力以及ROS水平進行相關(guān)性分析，計算皮爾遜相關(guān)分析系數(shù)，并采用Fisher檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁對IMR-32細胞損傷及對LDH水平的影響正常IMR-32細胞呈長梭形，貼壁生長，有聚集生長的特性，培養(yǎng)瓶底部干凈清晰；經(jīng)尼古丁處理后，細胞有回縮為圓形的趨勢，部分細胞脫落，瓶底出現(xiàn)細胞碎片或其他雜質(zhì)（見圖1）。與對照組相比，經(jīng)低、中、高劑量尼古丁處理，培養(yǎng)基LDH活力顯著升高。經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理細胞48 h后，培養(yǎng)基中LDH活力分別是對照組的1.14、1.50和1.70倍（均P＜0.05）。

圖1 尼古丁對IMR-32細胞損傷及對LDH水平的影響Fig.1 Effects of nicotine treatment on LDH levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.2 尼古丁抑制IMR-32細胞增殖 MTT實驗顯示，尼古丁可明顯抑制細胞增殖，濃度為0.1、1、10 nM時的活躍度依次為61%，53%，48%（均P＜0.05，見圖2）。

圖2 不同劑量尼古丁對IMR-32細胞增值的影響Fig.2 Effects of nicotine on proliferation of IMR-32 neuroblastoma cells in a dose-dependentmanner

2.3 尼古?。峁哦。獶AS對IMR-32細胞SOD活性的影響 實驗結(jié)果表明，低、中、高劑量的尼古丁均可使細胞SOD活力下降，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理后，培養(yǎng)基中SOD活力分別是對照組的76%、58%和44%（均P＜0.05）；加入低、中、高劑量的DAS處理后，細胞SOD活力升高，經(jīng)0.025、0.05、0.075 nM DAS處理后，SOD活力分別升高至尼古丁（1 nM）組的1.24、1.47和1.52倍（均P＜0.05）。

2.4 尼古丁對IMR-32細胞CYP2E1蛋白水平的影響 免疫熒光化學檢測顯示，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理細胞48 h后，IMR-32細胞CYP2E1表達明顯增加，分別升高至對照組的2.19、2.65及2.76倍（均P＜0.05，見圖3）。

圖3 尼古丁對IMR-32細胞CYP2E1蛋白水平的影響Fig.3 Effects of nicotine treatment on CYP2E1 levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.5 尼古丁對IMR-32細胞CYP2E1 mRNA水平的影響實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，尼古丁0.1、1、10 nM處理IMR-32細胞48 h，CYP2E1 mRNA表達水平未見升高（見圖4）。

圖4 尼古丁對IMR-32細胞CYP2E1 mRNA水平的影響Fig.4 Effects of nicotine treatment on CYP2E1 mRNA levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.6 尼古丁及DAS對細胞內(nèi)ROS水平的影響 與對照組相比，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理48 h后，IMR-32細胞中ROS含量分別升高1.48、1.65、2.36倍（均P＜0.05）；與尼古?。? nM）組相比，經(jīng)0.025、0.05、0.075 nM DAS處理后，ROS含量降低至77.8%、57.8%、44.3%（均P＜0.05）。

2.7 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析可知，CYP2E1含量與LDH活性呈正相關(guān)，與SOD活性呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.740（P＜0.01）和－0.584（P＜0.01），與ROS含量正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.695（P＜0.01）。

3 討論

本文觀察了不同劑量尼古丁對IMR-32細胞CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平的影響，并觀察了CYP2E1特異性抑制劑DAS，對尼古丁誘導ROS產(chǎn)生以及細胞氧化損傷的影響。結(jié)果表明，尼古丁處理可抑制IMR-32細胞增殖，產(chǎn)生細胞損傷，誘導ROS生成及CYP2E1表達，且均表現(xiàn)出劑量依賴性，但對mRNA水平無影響；抑制CYP2E1活性，可明顯減少ROS生成。尼古丁誘導細胞ROS生成機制尚不清楚［5-7］，本研究結(jié)果提示尼古丁致細胞ROS升高可能與其誘導CYP2E1水平相關(guān)。尼古丁可劑量依賴性誘導IMR-32細胞ROS生成。相對于其他CYP亞型，CYP2E1具有較高的NADPH氧化活性，這是由于CYP2E1蛋白空間結(jié)構(gòu)具有可變性，由于CYP2E1蛋白構(gòu)型的高速變化，底物與活性位點僅有短暫結(jié)合時間以進行活性氧轉(zhuǎn)移。尼古丁誘導CYP2E1后ROS產(chǎn)生增多，是否與上述信號通路激活有關(guān)需進一步研究［8-11］。當ROS生成增多時，機體會調(diào)動復雜的抗氧化系統(tǒng)來保證生物體內(nèi)氧化——抗氧化的平衡，抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶類和抗氧化劑組成，如SOD。IMR-32細胞經(jīng)尼古丁處理后，SOD活力下降，提示尼古丁產(chǎn)生的ROS引起了SOD的耗損［12-14］。當ROS含量超過機體清除能力時，則產(chǎn)生氧化損傷［15］。本實驗觀察到培養(yǎng)基LDH活力升高，提示IMR-32細胞經(jīng)尼古丁處理后細胞膜受到損傷。尼古丁處理可抑制IMR-32細胞增殖，導致細胞損傷，誘導CYP2E1蛋白表達，ROS生成增多，并表現(xiàn)出劑量依賴性，相關(guān)性分析提示，CYP2E1表達水平與IMR-32細胞ROS含量顯著相關(guān)；尼古丁通過CYP2E1對細胞產(chǎn)生氧化損傷的機制以及誘導神經(jīng)細胞CYP2E1表達的機制，以及尼古丁暴露時間對CYP2E1作用的差異尚需進一步研究。

本文結(jié)果表明，尼古丁可劑量依賴性抑制IMR-32細胞增殖，在轉(zhuǎn)錄后水平誘導CYP2E1蛋白表達，ROS生成增多；抑制腦CYP2E1活性，可明顯減少ROS生成量。相關(guān)性分析提示，CYP2E1可能參與尼古丁致神經(jīng)細胞氧化損傷。

［1］Wu BY，Liang HY，Chen DF.AssociationsofRsa Ipolymorphism at the 5′flanking region ofCYP2E1 and PON2 148 polymorphism in neonates with preterm delivery［J］.Journal of Genetics and Genomics，2003，30（6）：577-583.

［2］Gonzalez FJ.Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress：studies with CYP2E1［J］.Mutat Res，2005，569（1-2）：101-110.

［3］Upadhya SC，Tirumalai PS，Boyd MR，et al.Cytochrome P4502E（CYP2E）in brain：constitutive expression，induction by ethanol and localization by fluorescence in situ hybridization［J］.Arch Biochem Biophys，2000，373（1）：23-34.

［4］Howard LA，Miksys S，Hoffmann E，et al.Brain CYP2E1 is induced by nicotine and ethanol in ratand is higher in smokers and alcoholics［J］. Br JPharmacol，2003，138（7）：1376-1386.

［5］Lee AM，Yue J，Tyndale RF.In vivo and in vitro characterization of chlorzoxazonemetabolism and hepatic CYP2E1 levels in African Green monkeys：induction by chronic nicotine treatment［J］.Drug Metab Dispos，2006，34（9）：1508-1515.

［6］Cederbaum AI，Lu Y，Wu D.Role of oxidative stress in alcoholinduced liver injury［J］.Arch Toxicol，2009，83（6）：519-548.

［7］喬國偉，吸煙對人體的危害及其發(fā)病機理研究進展［J］.中外健康文稿，2009，6（01X）：16-18.

［8］俞銀姣，吸煙的危害與尼古丁替代療法［J］.藥物不良反應雜志，2008，10（5）：346-351.

［9］Hukkanen J，Jacob P，Benowitz NL.Metabolism and disposition kinetics of nicotine［J］.Pharmacol Rev，2005，57（1）：79-115.

［10］Wilkinson BL，Landreth GE.The microglial NADPH oxidase complex as a source of oxidative stress in Alzheimer's disease［J］.J Neuroinflammation，2006（2），3：30.

［11］Crowley-Weber CL，Dvorakova K，Crowley C，et al.Nicotine increases oxidative stress，activates NF-kappaB and GRP78，induces apoptosis and sensitizes cells to genotoxic／xenobiotic stressesby amultiple stress inducer，deoxycholate：relevance to colon carcinogenesis［J］.Chem Biol Interact，2003，145（1）：53-66.

［12］Nelson ME，Wang F，Kuryatov A，et al.Functional properties of human nicotinic AChRs expressed by IMR-32 neuroblastoma cells resemble those of alpha3beta4 AChRsexpressed in permanently transfected HEK cells［J］.JGen Physiol，2001，118（5）：563-582.

［13］Sapp DW，Yeh HH.Heterogeneity of GABA（A）receptor-mediated responses in the human IMR-32 neuroblastoma cell line［J］.JNeurosci Res，2000，60（4）：504-510.

［14］Hu Y，Oscarson M.Johansson I，et al.Genetic polymorphism of human CYP2E1：characterization of two variant alleles［J］.Mol Pharmacol，1997，51（3）：370-376.

［15］Zuber R，Anzenbacherova E，Anzenbacher P.Cytochromes P450 and experimentalmodels of drug metabolism［J］.JCell Mol Med，2002，6（2）：189-198.

（編校：譚玲，劉路路）

Roles of cytochrome P450 2E1 in neural cell of nicotine-induced oxidative injury

DANG Shuai1，ZHANG Hong-mei2

（1.Department of Neurosurgery，Center Hospital of Nanyang，Nanyang 473009，China；2.ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China）

ObjectiveTo investigate roles of CYP2E1 in neural cell damage induced by nicotine treatment.MethodsIn this study，IMR-32 neuroblastoma cells were cultured.Those cellswere ramdom ly divided into control group，low dose ofnicotine group，middle dose of nicotine group，and high dose of nicotine group.Those nicotine groupswere treated with nicotine（0.1，1 and 10 nM），whilemiddle dose of nicotine group was co-treated with nicotine（1 nM）and dially sulfide（0.025，0.05 and 0.075 nM）for48 hours.After treatment，levels of ROS，SOD，CYP2E1 protein and CYP2E1 mRNA were detected.The relationship between CYP2E1 protein levels and LDH，SOD，ROS levels were analysed by correlation analysis.ResultsCompared with control group，the results of nicotine groups showed that proliferation of IMR-32 neuroblastoma cells were suppressed after the treatment of low dose of nicotine，middle dose of nicotine and high dose of nicotine，and the suppression ratios were 39%，47%，52%respectively（all P＜0.05）.The lactate dehydrogenase significantly increased（1.14-fold，1.5-fold，1.7-fold，all P＜0.05），and superoxide dismutase significantly decreased to 76%，58%and 44%of control group（all P＜0.05）.The expression of CYP2E1 protein significantly increased（2.19-fold，2.65-fold，2.76-fold），and the levels of ROS significantly increased（1.48-fold，1.65-fold，2.36-fold）（all P＜0.05），while CYP2E1 mRNA did not change significantly.Compared withmiddle dose of nicotine group（1 nM），the levels of ROS decreasd（88.5%，79.9%，51.2%）and SOD increased（1.24-fold，1.47-fold，1.52-fold）after treatmentwith DAS（0.025，0.05 and 0.075 nM）.Correlation analysis demonstrated that CYP2E1 levelwas correlated to LDH（0.740），SOD（－0.584）and ROS（0.695）levels（all P＜0.01）.Conclusion Nicotine treatment could inhibit the proliferation of IMR-32 cells，induce brain CYP2E1 expression，induce ROS generation，and induce damage to nerve cells.

nicotine；cytochrome P450 2E1（CYP2E1）；ROS；neural cell

R966

A

1005－1678（2014）08－0034－04

高等學校博士學科點專項科研基金（20091417120003）

黨帥，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：顱腦損傷及腦血管病臨床研究，E-mail：dangs＠126.com。