干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)和細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用的研究

蘭亞明，何韶衡

（1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院急診科，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇南京210029）

干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)和細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用的研究

蘭亞明1，何韶衡2

（1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院急診科，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇南京210029）

目的探究干擾素-λ（interferon-λ，INF-λ）對(duì)肥大細(xì)胞Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）表達(dá)和細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。方法采用干擾素-λ激發(fā)肥大細(xì)胞P815，收集激發(fā)后2、6、16 h不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞及其上清液。采用MTT方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞P815的細(xì)胞活力的影響；采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4和IL-13的釋放量；通過Western blot方法檢測(cè)干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞Toll樣受體TLR2和TLR4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同時(shí)間的干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞P815的細(xì)胞活力均無顯著性差異；ELISA結(jié)果表明，干擾素-λ能刺激肥大細(xì)胞P815釋放IL-4和IL-13細(xì)胞因子，并且其釋放量與空白對(duì)照組具有顯著性差異（P＜0.01）；Western blot實(shí)驗(yàn)表明，與空白對(duì)照組相比，干擾素-λ激發(fā)肥大細(xì)胞P815后，不同時(shí)間點(diǎn)的給藥組均可上調(diào)TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)。當(dāng)給藥時(shí)間為16h時(shí)，其TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)具有顯著性上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論干擾素-λ刺激肥大細(xì)胞P815釋放IL-4和IL-13細(xì)胞因子可能是通過上調(diào)Toll樣受體TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)。

干擾素-λ；肥大細(xì)胞；Toll樣受體；細(xì)胞因子

以往有關(guān)干擾素-λ的研究主要集中在其抗病毒和抗腫瘤方面［1-3］。由于干擾素-λ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與白介素（IL）家族成員相似，所以現(xiàn)在越來越多的研究也集中在干擾素-λ與過敏性炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中［4-5］。Consol M等［6］發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞表達(dá)的干擾素-λ與過敏性哮喘的發(fā)生有關(guān)。特異性過敏原通過誘導(dǎo)CD4＋細(xì)胞釋放IL-4誘導(dǎo)干擾素-λ的釋放。此外，臨床研究也表明，干擾素-λ可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥性細(xì)胞的趨化作用［7-8］。

肥大細(xì)胞是過敏原引發(fā)過敏性炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞之一，其主要的過敏反應(yīng)為肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)。在初級(jí)效應(yīng)階段，肥大細(xì)胞被過敏原激活后進(jìn)而促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)過敏性介質(zhì)的合成和釋放，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［9］。相關(guān)研究表明，過敏原刺激后可誘導(dǎo)白細(xì)胞釋放IL-13和IL-4。然而，干擾素-λ能否刺激肥大細(xì)胞釋放IL-13和IL-4細(xì)胞因子？其可能的信號(hào)介導(dǎo)途徑又是如何？因此，本文旨在探究干擾素-λ能否刺激肥大細(xì)胞IL-13和IL-4細(xì)胞因子的釋放及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：注射用干擾素-λ（安耐吉化學(xué)，批號(hào)：20130705），DMEM／F-12培養(yǎng)基（HyClone公司，批號(hào)：NYE0874），DMEM培養(yǎng)基（低糖）（HyClone公司，批號(hào)：NYA0798），胎牛血清（HyClone公司，批號(hào)：NVM0877），鼠抗β-actin、鼠抗TLR2抗體、鼠抗TLR4抗體（Santa Cruz，批號(hào)：＃L0710）；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（中山金橋，批號(hào)：107015）；IL-4、TL-13 ELISA試劑盒（美國(guó)Biosource公司）。

1.1.2 主要儀器：ELX800UV酶標(biāo)儀（Bio-TEK公司）；CK2型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；光學(xué)顯微鏡（DP70，日本Olympus公司）；轉(zhuǎn)移電泳槽：DYY-III408（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將P851細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL和鏈霉素100μg／mL），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，相對(duì)飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞呈單純貼壁生長(zhǎng)，隔日換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%的密度，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3～5 d傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞激發(fā)：激發(fā)實(shí)驗(yàn)之前，先將P815細(xì)胞至于無血清的DMEM中培養(yǎng)7 h，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P8125細(xì)胞，種至6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，再將其置于無血清的DMEM中培養(yǎng)7 h，給藥組同時(shí)加入干擾素-λ（100 ng／mL），分別作用2、6、16 h。激發(fā)結(jié)束后，收集每組細(xì)胞上清液用于ELISA檢測(cè)，細(xì)胞用于提蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)TLR2和TLR4蛋白表達(dá)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)干擾素-λ對(duì)細(xì)胞活力的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肥大細(xì)胞P815配成（1×105個(gè)／m L）的混懸液接種于96孔板中，每組加入干擾素-λ（100 ng／mL）分別作用2、6、16 h?？瞻讓?duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液。作用結(jié)束后，每孔加入終濃度為5mg／mL的20μLMTT溶液放置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，除去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO），振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（absorbance，OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)IL-4和IL-13釋放水平：給藥組中加入干擾素-λ（100ng／mL）培養(yǎng)液1 mL／孔，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、6、16 h。另設(shè)單加空白培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組。采用ELISA法，分別取細(xì)胞上清液40μL檢測(cè)IL-4和IL-13釋放量。根據(jù)說明書具體操作。

1.2.5 Western blot檢測(cè)TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)：不同時(shí)間點(diǎn)處理后，收集細(xì)胞，每組加入含1%PMSF的蛋白裂解液，冰上裂解30min后，4℃15000 r／min離心30min，取上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組給予20μg的蛋白上樣量，SDSPAGE凝膠電泳，NC膜濕轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉2 h，TLR2、TLR4（mousemonoclonal IgG，1∶1000）4℃孵育過夜，PBST（含0.1% Tween 20的PBS）洗3次，每次10min。加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗3次，每次10min。采用化學(xué)發(fā)光方法顯影，定影，經(jīng)Adobe Photoshop 6.0（Adobe Systems，San Jose，CA）分析蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以±s”表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾素-λ對(duì)P815細(xì)胞活力的影響 本次結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同時(shí)間點(diǎn)的干擾素-λ均對(duì)P815細(xì)胞的損傷無明顯影響。此結(jié)果表明，干擾素-λ（100 ng／mL）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響與其調(diào)節(jié)細(xì)胞活力無關(guān)。并且此條件下，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，細(xì)胞存活率結(jié)果（見圖1）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)的干擾素-λ對(duì)P815細(xì)胞活力的影響1.對(duì)照組；2.2 h干擾素-λ給藥組；3.6h干擾素-λ給藥組；4.16 h干擾素-λ給藥組Fig.1 Effect of IFN-λat different times on the cell viability of P8151.Control group；2.2 h IFN-λtreatment group；3.6h IFN-λ treatment group；4.16h IFN-λtreatment group

2.2 干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞后對(duì)IL-4及IL-13表達(dá)水平的影響 干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞后，可刺激P815細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-4及IL-13。相對(duì)于對(duì)照組，不同時(shí)間點(diǎn)的激發(fā)給藥組其IL-4及IL-13分泌水平均明顯上升（P＜0.05，P＜0.01），并且顯示出明顯的時(shí)效關(guān)系（見表1）。

表1 干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞后IL-4及IL-13表達(dá)水平的影響（pg／mL）Tab.1 The effect of IFN-λon the secretion of IL-4 and IL-13 in P815（pg／mL）

2.3 干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞后對(duì)TLR2蛋白表達(dá)水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞2、6、16 h后TLR2蛋白的表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。結(jié)果顯示，干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞釋放細(xì)胞因子與Toll樣受體TLR2表達(dá)有關(guān)（見圖2）。

圖2 干擾素-λ對(duì)TLR2蛋白表達(dá)水平的影響1.對(duì)照組；2.2 h干擾素-λ給藥組；3.6h干擾素-λ給藥組；4.16 h干擾素-λ給藥組*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組相比Fig.2 Effect of IFN-λon the expression of TLR21.Control group；2.2h IFN-λtreatment group；3.6h IFN-λ treatment group；4.16h IFN-λtreatment group *P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

2.4 干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞后對(duì)TLR4蛋白表達(dá)水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，干擾素-λ激發(fā)P815細(xì)胞2、6、16 h后TLR4蛋白的表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。結(jié)果顯示，干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞釋放細(xì)胞因子與Toll樣受體TLR4表達(dá)有關(guān)（見圖3）。

圖3 干擾素-λ對(duì)TLR4蛋白表達(dá)水平的影響1.對(duì)照組；2.2 h干擾素-λ給藥組；3.6h干擾素-λ給藥組；4.16 h干擾素-λ給藥組*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組相比Fig.3 Effect of IFN-λon the expression of TLR41.Control group；2.2 h IFN-λtreatment group；3.6 h IFN-λ treatment group；4.16 h IFN-λtreatment group *P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group

3 討論

由于肥大細(xì)胞在天然免疫早期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著極為重要的作用，如調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子、脫顆粒的產(chǎn)生［10］。肥大細(xì)胞是過敏性疾病反應(yīng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，被公認(rèn)為哮喘效應(yīng)階段的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞。肥大細(xì)胞的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)主要是通過分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的發(fā)生，引起各種臨床過敏癥狀，從而在過敏性疾病中起重要作用。因此，相關(guān)的研究主要集中在肥大細(xì)胞的過敏反應(yīng)中。以往研究表明，過敏原（細(xì)菌、病毒或其產(chǎn)物）都可激活肥大細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)發(fā)揮宿主防御效應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（2、6、16 h）干擾素-λ（100 ng／mL）對(duì)肥大細(xì)胞P815細(xì)胞活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同時(shí)間點(diǎn)的干擾素-λ對(duì)P815的細(xì)胞活力的影響均無顯著性差異。此結(jié)果顯示，干擾素-λ對(duì)肥大細(xì)胞P815的調(diào)節(jié)作用與細(xì)胞活力無關(guān)。因此，本文繼續(xù)探究其可能的炎癥調(diào)節(jié)作用。

IL-4、IL-13是由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞誘發(fā)產(chǎn)生的，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用［11］。以往研究發(fā)現(xiàn)，在過敏原刺激后哮喘患者的上皮細(xì)胞釋放的IL-4和IL-13會(huì)明顯升高，因此，IL-4、IL-13和其他細(xì)胞因子在過敏反應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的調(diào)控作用。本次研究表明，干擾素-λ可激發(fā)肥大細(xì)胞P815釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-13，該結(jié)果顯示，干擾素-λ發(fā)揮其免疫應(yīng)答調(diào)控的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-4和IL-13的表達(dá)釋放有關(guān)。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是可識(shí)別病原相關(guān)分子模型的識(shí)別受體（pathogen associated molecule patterns，PMAPs）。肥大細(xì)胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之一，因此有關(guān)肥大細(xì)胞TLRs受體表達(dá)和功能的研究引起了越來越多的關(guān)注，相關(guān)研究表明Toll樣受體在不同的組織和細(xì)胞中分布不同，以往研究表明肥大細(xì)胞表達(dá)TLR2和TLR4［12-15］。因此，本文主要觀察肥大細(xì)胞P815中TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平的變化。本次研究表明，干擾素-λ激活P815后，可上調(diào)Toll樣受體TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)。此次結(jié)果提示，干擾素-λ可能是通過上調(diào)TLR2和TLR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活P815釋放炎癥細(xì)胞因子IL-4和IL-13，此結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)充了干擾素-λ在炎癥反應(yīng)中可能的作用機(jī)制。

綜上所述，干擾素-λ可能通過調(diào)控Toll樣受體TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)炎癥細(xì)胞因子的釋放。此次結(jié)果可能說明干擾素-λ在對(duì)抗細(xì)菌病原體的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為研究肥大細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制提供了更多的理論依據(jù)。

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（編校：吳茜，劉路路）

Study on regulatory role of interferon-λfor mast cell toll-like receptor expression and cytokine secretion

LAN Ya-ming1，HE Shao-heng2

（1.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities，Enshi445000，China；2.Department of Clinical Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the interferon-λ（interferon-λ，INF-λ）of themast cell Toll-like receptors（TLRs）regulation of expression and cytokine secretion.MethodsInterferon-λstimulatedmast cells P815，after2，6，16h，cells and supernatantswere collected at different time points.Using MTTmethod at different time points to detect interferon-λimpact on cell viability ofmast cells P815；using ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）to detect cytokines IL-4 and IL-13 emission；through Western blotmethod for detecting expression of interferon-λToll-like receptors on mast cells TLR2 and TLR4 protein.ResultsMTT results showed that at different times，interferon-λ's impact on mast cells P815 viability showed no significant difference；ELISA results showed that interferon-λ's impact on mast cells P815 could stimulate the release of IL-4 and IL-13 cytokines，and its release compared with the control group had significant difference（P＜0.01）；Western blot experiments showed that，compared with the control group，after interferon-λstimulatemast cells P815，administration group atdifferent time points could raise expression of TLR2 and TLR4 protein.When the delivery time was 16 h，TLR2 and TLR4 protein expression significantly increased（P＜0.01）.Conclusion Mast cells stimulated by IFN-λrelease P815 IL-4 and IL-13 cytokinesmay be regulated by the expression of Toll-like receptors TLR2 and TLR4 protein.

interferon-λ；mast cells；Toll-like receptor；cytokines

R735.1

A

1005－1678（2014）08－0012－04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81030054）

蘭亞明，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：急診急救，E-mail：qch1821460036＠163.com。