雙調(diào)控溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤EJ細(xì)胞的殺傷作用

陳波， 史振鐸， 邱祥政， 韓從輝

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 徐州 221009)

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，目前治療的主要方法是手術(shù)切除后膀胱灌注化療藥或免疫治療藥物，但仍有較高的復(fù)發(fā)率，其中膀胱灌注卡介苗(BCG)的免疫治療效果最佳，但由于BCG具有較大的毒副作用而限制了其在臨床上的應(yīng)用。我們?cè)鴺?gòu)建由人端粒酶啟動(dòng)子(hTERT)和缺氧誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子(HIF)雙向調(diào)控的攜帶SEA基因的選擇性增殖腺病毒，該腺病毒可以在鼠膀胱癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SEA蛋白[1]。本研究觀察該腺病毒對(duì)膀胱癌的抑制效果，為膀胱癌臨床治療方法的探索提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膀胱腫瘤EJ細(xì)胞、蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海愛博生物醫(yī)藥科技有限公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司。RT-PCR引物合成于上海卓康生物科技有限公司。SEA單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司。FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自上海史瑞可生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 共培養(yǎng) 分別計(jì)數(shù)1×107個(gè)EJ細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后向其中1瓶加入20 μl病毒液轉(zhuǎn)染細(xì)胞。12 h給細(xì)胞換液1次，取5 ml新鮮血液加入無菌離心管與PBS按1∶1比例混勻，平均緩慢加入兩只裝有5 ml人淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，1 500 r·min-1、20 ℃離心10 min，用5 ml注射器小心吸取白色霧狀層，加入離心管，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，PBS洗1次，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞，分別加入兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞變化。

1.2.2 體外抗腫瘤活性測(cè)定 取效應(yīng)細(xì)胞淋巴細(xì)胞、靶細(xì)胞及感染溶瘤腺病毒靶細(xì)胞(1×104個(gè))，調(diào)整效靶比40∶1、20∶1、10∶1接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)組加淋巴細(xì)胞與感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ細(xì)胞，靶細(xì)胞組加EJ細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞組加單純淋巴細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2孵育。同法種3板。孵育12、24和48 h時(shí)取1板，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各孔OD值，按下述方法計(jì)算淋巴細(xì)胞殺傷率：

ODE+T=效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞孔OD值；ODE=相應(yīng)濃度單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞的OD值；ODT=相應(yīng)濃度單獨(dú)靶細(xì)胞的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 14.0軟件，用配對(duì)t檢驗(yàn)、多因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)

見圖1。

A.陰性(單純EJ細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng))組 ×10； B.陽(yáng)性(感染溶瘤腺病毒的EJ細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng))組 ×10； C.陰性組 ×40； D.陽(yáng)性組 ×40

圖1顯微鏡下感染溶瘤腺病毒膀胱癌EJ細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48h

Fig1UnderthemicroscopeoncolyticadenovirusinfectionofbladdercancerEJcellsandlymphocyteswereculturedfor48h

2.2 轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞腫瘤殺傷結(jié)果

轉(zhuǎn)染超抗原膀胱癌EJ細(xì)胞較單純膀胱癌EJ細(xì)胞殺傷率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在時(shí)間上3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在濃度上10∶1組較40∶1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，10∶1組較20∶1組及20∶1組較40∶1組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，故濃度40∶1組殺傷率最高。見表1。

3 討 論

迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的超抗原是T細(xì)胞絲裂原，能夠在較低的濃度下刺激T淋巴細(xì)胞分裂。SEA作為超抗原的一員，以完整形態(tài)結(jié)合到抗原提呈細(xì)胞(APC)表面表達(dá)MHCⅡ類分子的抗原合溝槽的外側(cè)，而后與T細(xì)胞受體(TCR) 的β鏈V區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞大量增殖。腺病毒是一種中等大小的病毒，直徑70～90 nm，無包膜，呈20面體立體對(duì)稱[2-3]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)人腺病毒51種血清型，并分為A、B、C、D、E、F 6個(gè)亞群。不同腺病毒因其親嗜性不同表現(xiàn)出特定的器官選擇性。普通腺病毒對(duì)人體正常組織具有不穩(wěn)定的感染能力，導(dǎo)致人患各種腺病毒引發(fā)的疾病。溶瘤病毒是一類具有特殊感染和裂解腫瘤細(xì)胞能力，并且對(duì)正常細(xì)胞無損傷的病毒，溶瘤腺病毒是通過基因工程對(duì)已知生物學(xué)特性的腺病毒進(jìn)行改造得到的，針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面TSA、TAA及高表達(dá)分子，在腺病毒基因內(nèi)加載相關(guān)基因獲得高效識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的生物制品[4-5]。

表1淋巴細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染超抗原膀胱癌EJ細(xì)胞的殺傷率

Tab1Thekillingrateoflymphocytesforbladdercancercelltransfectedwithsuperantigen

時(shí)間組轉(zhuǎn)染超抗原膀胱癌EJ細(xì)胞殺傷率/%10∶120∶140∶1單純膀胱癌殺傷率/%10∶120∶140∶112 h組11.47±0.3027.95±0.4544.75±0.769.76±0.3110.35±0.4414.60±0.8224 h組13.25±0.4537.15±0.4643.86±0.7412.43±0.6513.97±0.6719.65±0.7148 h組12.58±0.5336.52±0.5639.54±0.979.45±0.2913.16±0.3117.98±0.83

文獻(xiàn)報(bào)道肝癌細(xì)胞Hepa1-6感染重組腺病毒AdAFPSEA可活化CD4+和CD8+T細(xì)胞，體內(nèi)試驗(yàn)在腫瘤組織中檢測(cè)到SEA的表達(dá)，肝癌細(xì)胞移植瘤被抑制，小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，這些結(jié)果表明腺病毒攜帶的SEA能產(chǎn)生強(qiáng)大的局部和全身抗腫瘤作用[6-7]。本研究通過將改造好的溶瘤腺病毒加載上目的基因達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性殺傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)過程中感染與未感染的腫瘤細(xì)胞數(shù)量存在明顯差異，初步證實(shí)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果[8]。

本研究成功改造的溶瘤腺病毒攜帶目的基因，達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)染的目的，成功地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)初步解決了在腫瘤治療過程中的無目標(biāo)性及靶向治療膀胱癌，大大減少了對(duì)正常組織的損傷。本實(shí)驗(yàn)過程中只對(duì)比了感染與未感染腫瘤細(xì)胞之間的差異，我們正在對(duì)此種治療腫瘤方法的藥物代謝學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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