異丙腎上腺素腹腔注射后SD大鼠下頜下腺的組織學(xué)觀察

唐岳鵬 胡潔 黃桂林

涎腺細(xì)胞的增殖和營(yíng)養(yǎng)與交感副交感的神經(jīng)刺激、激素的調(diào)節(jié)有十分密切的關(guān)系［1］。β-腎上腺素能激動(dòng)劑異丙腎上腺素注射后, 能夠在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物涎腺腺泡細(xì)胞增殖、肥大［2］；誘導(dǎo)大鼠腮腺閏管細(xì)胞分裂增殖, 表現(xiàn)出腺泡細(xì)胞免疫組織化學(xué)性質(zhì)［3］。本文通過(guò)腹腔注射IPR, 觀察下頜下腺具有干/祖細(xì)胞特征細(xì)胞的增殖和功能變化。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性Sprague-Dawlye大鼠(SD大鼠), 180～200 g,SPF級(jí), 第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸異丙腎上腺素(2 ml:1 mg, 上海禾豐制藥有限公司)。一抗：小鼠抗人淀粉酶單克隆抗體(Santa Cruz, USA)；兔抗大鼠Ki-67多克隆抗體 (武漢博士徳公司) 。二抗：Envision兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒, EDTA 抗原修復(fù)液, DAB 顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 12只雄性SD大鼠隨機(jī)分成IPR注射組和對(duì)照組。IPR注射組按20 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射鹽酸異丙腎上腺素, 2次/d(8 AM, 8 PM), 連續(xù)注射5 d。對(duì)照組則以無(wú)菌生理鹽水代替鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射。5 d后處死動(dòng)物并取出腺體。將獲得的腺體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 免疫組化染色采用兩步法, 按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

最后用DAB 顯色, 蘇木精復(fù)染。

2 結(jié)果

2.1 下頜下腺HE染色 IPR注射5 d后, 腺泡及腺泡細(xì)胞體積較對(duì)照組明顯增大。導(dǎo)管系統(tǒng)清晰, 導(dǎo)管細(xì)胞未見(jiàn)改變,見(jiàn)圖1(A和B)。

2.2 異丙腎上腺素注射后的組織變化 Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)染色見(jiàn)大部分腺泡細(xì)胞核呈棕褐色；個(gè)別導(dǎo)管細(xì)胞胞核呈褐色；對(duì)照組偶可見(jiàn)細(xì)胞核著色, 見(jiàn)圖2(A和B)。Amylase免疫細(xì)胞化學(xué)染色, IPR組導(dǎo)管細(xì)胞及導(dǎo)管附近細(xì)胞胞漿內(nèi)可陽(yáng)性顆粒狀；對(duì)照組Amylase陽(yáng)性顆粒主要位于腺泡細(xì)胞中,見(jiàn)圖2(C和D)。Ki-67與Amylase免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)時(shí)與對(duì)照組有較大差別。

圖1 下頜下腺HE染色

圖2 兩組SD大鼠下頜下腺組織免疫組化檢測(cè)

3 討論

Ki-67是在細(xì)胞周期除G0期和G1早期階段以外出現(xiàn)的核抗原, 其半衰期短, 能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性, 廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和臨床病理學(xué)檢測(cè)。5 d的IPR注射后,Ki-67標(biāo)記的腺泡細(xì)胞明顯增加, 標(biāo)記的閏管細(xì)胞也有所增多。以往的研究表明, 反復(fù)注射IPR能增強(qiáng)大鼠腮腺閏管細(xì)胞［4］和下頜下［5］腺體細(xì)胞的有絲分裂和肥大。作者的研究也現(xiàn)示, IPR注射能促使大鼠下頜下腺閏管細(xì)胞的增殖。在正常涎腺組織中, Amylase僅存在于腺泡細(xì)胞的分泌顆粒中,導(dǎo)管細(xì)胞, 包括閏管細(xì)胞均不表達(dá)Amylase。定量免疫組織化學(xué)分析顯示, IPR能導(dǎo)致腺泡細(xì)胞Amylase減少至正常值的10%, 停藥后能恢復(fù)至正常水平［6］。這有可能是IPR導(dǎo)致新形成的腺泡細(xì)胞過(guò)度分化所致。作者研究發(fā)現(xiàn), IPR注射5 d后, 腺泡細(xì)胞中幾乎很難見(jiàn)到Amylase陽(yáng)性的分泌顆粒,而在閏管區(qū)的細(xì)胞中可以見(jiàn)到Amylase陽(yáng)性的分泌顆粒。從形態(tài)特征上看, 這些細(xì)胞可能是閏管細(xì)胞分化為腺泡細(xì)胞的過(guò)渡細(xì)胞。此外, 這些過(guò)渡細(xì)胞出現(xiàn)在腺泡和閏管的交界處從另一個(gè)方面證實(shí)IPR注射后閏管細(xì)胞分化成腺泡細(xì)胞。Katsumata O［3］等發(fā)現(xiàn)連續(xù)5 d的IPR注射后, 腮腺腺泡細(xì)胞的總數(shù)增加了1.6倍, 而閏管細(xì)胞或小葉內(nèi)導(dǎo)管細(xì)胞的總數(shù)沒(méi)有增加也證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述, 本研究認(rèn)為閏管細(xì)胞中存在能夠轉(zhuǎn)化為腺泡細(xì)胞的成體干細(xì)胞, 在發(fā)生大量的細(xì)胞死亡或強(qiáng)烈的刺激增殖, 如IPR的注射, 下頜下腺干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂, 開(kāi)始表達(dá)這些潛在特性并分化為腺泡細(xì)胞。

［1］Riva A, Puxeddu R, Loy F, et al.Serous and mucous cells of human submandibular salivary gland stimulated in vitro by isoproterenol,carbachol and clozapine: an LM, TEM, and HRSEM Study.Eur J Morphol, 2003, 41(2): 83-87.

［2］Denny PC, Denny PA.DNA synthesis and cell division.In:Dobrosielski-Vergona K (ed) Biology of the salivary glands.CRC Press, Boca Raton, 1993:263-281.

［3］Katsumata O, Sato Y, Sakai Y, et al.Intercalated duct cells in the rat parotid gland may behave as tissue stem cells.Anat Sci Int, 2009,84(3): 148-154.

［4］Hand AR, Ho B.Mitosis and hypertrophy of intercalated duct cells and endothelial cells in the isoproterenol-treated rat parotid gland.J Dent Res, 1985, 64(8):1031-1038.

［5］Van den Brenk HA, Sparrow N, Moore V.Effect of X-ray irradiation on salivary gland growth in the rat.II.Quantitative studies on sialoadenotrophism induced with isopropylnoradrenaline and its modification by single doses of X-rays.Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 1970, 17(2):135-161.

［6］Vugman I, Hand AR.Quantitative immunocytochemical study of secretory protein expression in parotid glands of rats chronically treated with isoproterenol.Microsc Res Tech, 1995, 31(2):106-117.