LINE-1核酸內(nèi)切酶變異體GCRG213在人正常胃黏膜的表達(dá)

廉宏偉 李 杰 王衛(wèi)華 段曉劍 王剛石

(中國人民解放軍總醫(yī)院南樓消化科，北京 100853)

胃癌相關(guān)基因213(GCRG213)是由本實(shí)驗(yàn)室通過比較人胃竇部低分化腺癌、癌旁和正常胃黏膜組織的基因表達(dá)，采取應(yīng)用熒光標(biāo)記的mRNA差異顯示技術(shù)，篩選出的一條胃癌組織高表達(dá)基因序列〔1〕。已有研究〔2,3〕證明GCRG213是有功能的LINE-1中核酸內(nèi)切酶(EN)的變異體。免疫組織化學(xué)分析顯示，GCRG213蛋白在胃癌細(xì)胞的胞質(zhì)中呈現(xiàn)陽性信號，而在胃癌病變切緣的非癌變組織中，黏膜層的被覆上皮表達(dá)均為陰性〔3〕。近期研究發(fā)現(xiàn)，GCRG213蛋白在正常胃黏膜的部分固有腺體細(xì)胞呈陽性表達(dá)。本研究擬進(jìn)一步探討GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達(dá)特征。

1 資料與方法

1.1材料和對象 試劑： 3%過氧化氫、檸檬酸修復(fù)液(pH=6.0)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.2～7.4)、即用型山羊抗鼠免疫組化試劑盒、二氯基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、中性樹膠等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。鼠抗人GCRG213單克隆抗體由解放軍總醫(yī)院南樓消化科實(shí)驗(yàn)室制備并保存。蘇木素染色液，1%鹽酸酒精，0.5%伊紅染色液，二甲苯、不同濃度酒精均為本實(shí)驗(yàn)室配制。儀器：高溫烤箱(重慶萬達(dá))，微波爐(日立)，顯微鏡(奧林巴斯，BX60)

人正常胃黏膜組織共97例，標(biāo)本取自解放軍總醫(yī)院手術(shù)切除的胃標(biāo)本或胃鏡活檢標(biāo)本，所有的組織均通過10%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，蠟塊行4 μm連續(xù)切片，室溫保存。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法 蘇木素-伊紅(HE)染色 將組織切片放置80℃烤箱內(nèi)烤20 min，放入二甲苯脫蠟，乙醇濃度逐級遞減進(jìn)行水化，蘇木素染液浸染5 min，流水沖洗5 s，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗10 min，1%伊紅染液1 min，流水沖洗數(shù)秒，酒精由低至高濃度逐級脫水，置二甲苯透明，用中性樹膠封片。

免疫組化染色 常規(guī)脫蠟并水化(步驟同上)；PBS洗3次，5 min/次，加3%過氧化氫12 min去除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗3次，5 min/次,檸檬酸(pH=6.0)修復(fù)液高火煮沸后加入組織切片，中低火微波12 min，室溫冷卻約40 min；PBS洗3次，5 min/次，加GCRG213鼠抗人單克隆抗體(稀釋比例1∶1 000)，4℃冰箱過夜；次日PBS洗3次，5 min/次，加聚合物輔助劑孵育15 min，PBS洗3次，5 min/次,加辣根酶標(biāo)記抗小鼠IgG多聚體(小鼠超敏試劑盒PV9002)15 min; PBS洗3次，5 min/次,滴加DAB顯色，清水終止染色，常規(guī)脫水、透明、封片(步驟同上)。實(shí)驗(yàn)陰性對照采用PBS代替一抗，陽性對照采用人胃癌組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

GCRG213蛋白在胃黏膜腺體細(xì)胞表達(dá)陽性的判斷：陽性信號為細(xì)胞質(zhì)呈淡黃色-深棕黃色。本實(shí)驗(yàn)中97例胃黏膜主細(xì)胞都有表達(dá)，用顏色深淺表示表達(dá)強(qiáng)度：淺黃色為低度表達(dá)，淺棕色為中度表達(dá)，深棕黃色為高度表達(dá)。

1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達(dá) 采用無胃部基礎(chǔ)疾病的人正常胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的部分固有腺體有陽性表達(dá)信號。顯微鏡下清晰可見在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈均勻或顆粒狀的淺黃色-深棕黃色信號，該陽性信號以靠近黏膜下層的固有腺體尤為明顯，而在近胃腔側(cè)的固有腺體中陽性信號逐漸減弱，至黏膜被覆上皮則呈陰性(圖1)。進(jìn)一步觀察黏膜固有層GCRG213蛋白陽性表達(dá)的腺體，發(fā)現(xiàn)僅部分細(xì)胞的胞漿表達(dá)陽性，結(jié)合HE染色結(jié)果，明確GCRG213蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞均為主細(xì)胞(如圖1中箭頭①所示)，HE染色觀察該細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞核圓形，位于細(xì)胞的底部，胞質(zhì)嗜堿性很強(qiáng)，染成紫藍(lán)色。固有腺體中GCRG213蛋白陰性表達(dá)的細(xì)胞為壁細(xì)胞(如圖1中箭頭②所示)，該細(xì)胞體積比較大，呈圓形或三角形，細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)嗜酸性，HE染色呈紅色。表面黏液細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞主要位于胃黏膜的表面和頸部，細(xì)胞呈柱狀或燒瓶狀，細(xì)胞核呈扁圓形，位于基底部，胞質(zhì)染色較淺，GCRG213蛋白在這兩種黏液細(xì)胞的表達(dá)也呈陰性(如圖1中箭頭③、④所示)。

2.2GCRG213蛋白表達(dá)與患者基本特征之間的關(guān)系 收集97例人正常胃黏膜組織，年齡27～84歲，平均57歲，免疫組化發(fā)現(xiàn)胃固有腺體的主細(xì)胞胞漿均可見GCRG213蛋白表達(dá)，進(jìn)一步分析其表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、性別、吸煙史和飲酒史的關(guān)系。在男性患者中，GCRG213蛋白呈低度或中度表達(dá)的比例略高于女性；在老年組中，該蛋白呈低度和高度表達(dá)的比例略高；在吸煙和飲酒患者中，此蛋白呈中度表達(dá)的患者比例均高于未吸煙飲酒患者。上述各參數(shù)進(jìn)行組間和組內(nèi)比較差異不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達(dá)〔n(%)〕

A：GCRG213蛋白在正常人胃黏膜的表達(dá)(×100，IHC)；B：與A同一組織連續(xù)切片的HE染色(×100，HE)；C、D分別為A，B固有腺體中同一區(qū)域的放大圖(×400)；圖中箭頭所指①為主細(xì)胞；②為壁細(xì)胞。E、F分別為A、B胃黏膜表面同一區(qū)域的放大圖(×400)，圖中箭頭所指③為表面黏液細(xì)胞④頸黏液細(xì)胞

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)GCRG213表達(dá)陽性的細(xì)胞主要是胃黏膜近黏膜下層的固有腺體中的主細(xì)胞，表達(dá)部位在胞質(zhì)。主細(xì)胞是胃固有腺體中的主要細(xì)胞，位于腺體基底部，數(shù)目最多，這種細(xì)胞分泌胃蛋白酶原(PG)，故又稱胃酶原細(xì)胞。胃蛋白酶是胃中唯一的一種蛋白水解酶，以PG顆粒形式分泌，經(jīng)胃液中鹽酸激活后，具有消化蛋白質(zhì)的能力。但是GCRG213蛋白在同一腺體的壁細(xì)胞中則表達(dá)陰性，壁細(xì)胞主要是由胃黏膜腺體峽部的干細(xì)胞增殖分化形成〔4〕，主要分泌鹽酸，又稱泌酸細(xì)胞。正常情況下，這兩種細(xì)胞通過調(diào)節(jié)胃酸的分泌，共同保護(hù)胃黏膜屏障。PG為胃蛋白酶沒有活性的前體，目前根據(jù)其生化性質(zhì)和免疫原性將其分為PGI(PGA)、PGⅡ(PGC)兩個(gè)亞群，有文獻(xiàn)〔5〕報(bào)道PGC是胃黏膜主細(xì)胞的標(biāo)志物分子，其在胃黏膜的主細(xì)胞特異性表達(dá)，并采用PGC基因的啟動子，實(shí)現(xiàn)Cre重組酶在主細(xì)胞的特異性表達(dá)。本文發(fā)現(xiàn)GCRG213蛋白在胃黏膜主細(xì)胞高表達(dá)，故推測該蛋白表達(dá)與主細(xì)胞的功能有關(guān)，可能與主細(xì)胞分泌的PG也存在一定關(guān)系。一般認(rèn)為在低酸環(huán)境下，PG更多被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘奈傅鞍酌福蛊渌獾鞍踪|(zhì)的能力增強(qiáng)，這樣就有可能削弱胃黏膜的屏障功能，導(dǎo)致消化性潰瘍甚至癌變的發(fā)生，也有文獻(xiàn)〔6〕報(bào)道胃蛋白酶是胃癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤標(biāo)志物。然而在同一腺體中，分泌鹽酸的壁細(xì)胞中GCGR213蛋白則呈陰性表達(dá)，此外該蛋白在胃黏膜被覆上皮的表面黏液細(xì)胞也呈陰性表達(dá)，這提示GCRG213可能與胃酸的分泌和黏液的分泌無必然相關(guān)性。有文獻(xiàn)〔7〕報(bào)道PG的產(chǎn)生不僅局限在胃底腺，還有胃竇的黏液細(xì)胞和近端十二指腸的Brunner腺體，同時(shí)前列腺和胰腺也可產(chǎn)生，GCRG213在其他組織腺體的表達(dá)情況需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

隨著年齡增長，老年人胃黏膜發(fā)生萎縮性改變，固有腺體減少并且變得稀薄，主細(xì)胞隨之較少，Majumdar等〔8〕通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，老齡鼠的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生退化性改變；Maitra等〔9〕證明老齡鼠的PG濃度較非老齡鼠的低；有研究報(bào)道〔10〕發(fā)現(xiàn)老齡鼠的胃蛋白酶活力較非老齡鼠的低；同時(shí)有學(xué)者報(bào)道〔11,12〕隨著年齡增長，胃蛋白酶的mRNA水平下降。以上諸多研究證明主細(xì)胞的功能隨著年齡的增長而慢慢退化。本研究未發(fā)現(xiàn)GCRG213蛋白表達(dá)在老年組和非老年組之間存在差異，說明該蛋白在主細(xì)胞中的表達(dá)并不隨著年齡的增長而發(fā)生改變，另一方面，本研究選取的標(biāo)本是組織學(xué)觀察正常的胃黏膜腺體，沒有分析老年人常見的胃黏膜腺體萎縮狀態(tài)下GCRG213蛋白的變化，值得進(jìn)一步研究。

GCRG213是長散布核元件(LINE-1)的核酸內(nèi)切酶的變異體，LINE-1是人類基因組中最豐富自主轉(zhuǎn)座的非末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其活動可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。LINE-1有2個(gè)讀碼框，分別是ORF1和ORF2〔13〕，ORF2編碼的蛋白具有核酸內(nèi)切酶(EN)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性〔14〕，GCRG213-ORF編碼的氨基酸序列與LINE-1的EN高度同源〔3〕。有文獻(xiàn)〔15〕報(bào)道GCRG213正義轉(zhuǎn)染可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的成瘤性，并通過免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，抗GCRG213蛋白的抗體可以與胃癌SGC-7901細(xì)胞蛋白特異結(jié)合，但與胃上皮HFE-145細(xì)胞蛋白無特異性結(jié)合，說明GCRG213抗體具有一定的腫瘤特異性〔16〕。有研究〔17,18〕報(bào)道主細(xì)胞分泌的PG水平在胃炎、胃潰瘍、胃癌病變中逐漸降低，其可作為一個(gè)癌變指標(biāo)，本文發(fā)現(xiàn)GCRG213蛋白在主細(xì)胞高表達(dá)，結(jié)合其在胃癌細(xì)胞也呈高表達(dá)，設(shè)想胃癌細(xì)胞與主細(xì)胞是否來源同一個(gè)生發(fā)中心，這為研究胃癌的發(fā)生提供了一條新思路。

綜上，GCRG213蛋白在人胃黏膜主細(xì)胞特異性表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)其在患者中的隨齡改變。推測該蛋白表達(dá)可能與主細(xì)胞功能有關(guān)，具體機(jī)制需要更多研究證明。該蛋白在萎縮性胃炎和胃潰瘍等胃部疾病及其他部位如腸道、肝臟、胰腺等的表達(dá)情況將在下一步實(shí)驗(yàn)中研究。

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