siRNA靶向干擾IL-12基因?qū)δX膠質(zhì)瘤細胞增殖與凋亡的影響

翟 旭 張啟財

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001)

腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，目前多采用外科治療與放療、化療相結(jié)合的療法，治療效果難以滿意〔1〕。白細胞介素(IL)-12可以在細胞的生理變化中促進TH1細胞增殖和活化，還可以促進自然殺傷(NC)細胞增殖和分化。在體內(nèi)IL-12可以增強機體抵抗細菌、病毒侵害的能力，促進抗腫瘤免疫，增強抗病毒效應(yīng)。RNA干擾技術(shù)目前在基因治療中應(yīng)用廣泛，是現(xiàn)今沉默某些目標致癌基因的常用手段〔2〕。在本實驗中將已制備好的IL-12 siRNA表達載體成功轉(zhuǎn)染至處于對數(shù)生長期的U251細胞，通過western 印跡法檢測其對U251細胞IL-12蛋白表達，通過噻唑藍(MTT)法和吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)法檢測檢測其對U251細胞增殖、凋亡的影響，為進一步基因治療腦膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗材料 人腦膠質(zhì)瘤細胞株(U251，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實驗室制備)，鼠抗人IL-12多克隆抗體，轉(zhuǎn)染用IL-12 siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染劑陽離子脂質(zhì)體，RIPA裂解液，MTT試劑盒，Biorad凝膠成像系統(tǒng)，AO/EB雙染色試劑盒。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組 本實驗分為：轉(zhuǎn)染control-siRNA組(control組)，不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(negative組)，轉(zhuǎn)染IL-12 siRNA質(zhì)粒組(IL-12 siRNA組)。

1.2.2IL-12 siRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前24 h進行，將對數(shù)生長期的U251細胞株以5 ml/孔的劑量，分別接種于6孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板每孔均設(shè)4個復(fù)孔，接種完畢后立即按照LIPOFECTAMINE 2000說明書進行IL-12 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h后置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.2.3western 印跡實驗檢測IL-12蛋白的表達水平 在成功轉(zhuǎn)染72 h后，收集各組轉(zhuǎn)染好的U251細胞，使用RIPA裂解液放置于冰上進行裂解，保持4℃，13 000 r/min離心10 min，收集離心后所得上清液即可得到總蛋白。分別加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液緩沖搖勻后，保持100℃溫度煮沸使蛋白變性5 min。所得樣品中的蛋白經(jīng)Bradford定量，能夠保證蛋白上樣量的一致。然后通過12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，加入一抗鼠抗人IL-12多克隆抗體(1∶3 000)和一抗鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，在4℃培養(yǎng)箱孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗膜10 min，洗膜3次。二抗采用1∶20稀釋好的羊抗鼠(通用型生物素標記)IgG(1∶3 000)，顯色方法采用化學(xué)發(fā)光法。完成后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分別檢測實驗所得各條帶的灰度值，可以檢測各組IL-12蛋白的表達情況。

1.2.4MTT法檢測膠質(zhì)瘤細胞(U251)的增殖情況 把各組細胞經(jīng)消化處理后，配置成為2×104/ml濃度水平的細胞懸液，然后分別接種于96孔板，劑量為200 μl/孔，每組均設(shè)6枚復(fù)孔。同時設(shè)置試劑組，不加任何細胞。觀察細胞完成貼壁后，分別于0、24、48、72、96 h加入5 mg/L的MTT溶液(MTT 0.5 g，溶于100 ml的PBS液)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后丟棄上清液。加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl/孔。酶標儀于570 nm處測定吸光度值(A570)，并繪制對數(shù)生長曲線。

1.2.5AO/EB法檢測膠質(zhì)瘤細胞(U251)的凋亡率 各組細胞經(jīng)收集后離心，丟棄上清液后用PBS洗滌3次，制成細胞懸液，各組均加入濃度100 mg/L的AO及EB試劑，混合均勻后，滴于載玻片上，并分別計數(shù)200個以上細胞的凋亡率。細胞經(jīng)過染色后，核染色質(zhì)呈綠色者為活細胞(VN)，可觀察到正常細胞結(jié)構(gòu)；核染色質(zhì)呈綠色者為早期凋亡細胞(VA)，呈圓珠狀或固縮狀；核染色質(zhì)呈橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)者為非凋亡的死細胞(NVN)；核染色質(zhì)呈橘紅色并呈破裂裝或固縮狀〔1〕者為晚期凋亡細胞(NVA)。細胞凋亡率=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)。

2 結(jié) 果

2.1Western 印跡法測定IL-12蛋白的表達水平 實驗組的IL-12蛋白表達(0.225±0.052)較control組(0.836±0.047)及negative組(0.978±0.034)明顯減少，其表達水平約為negative組的83%。表明IL-12 siRNA表達載體在U251細胞轉(zhuǎn)染成功，并可顯著降低IL-12基因的表達水平。見圖1。

圖1 western 印跡分析各組IL-12蛋白表達情況

圖2 各組U251細胞的生長曲線

2.2MTT法實驗結(jié)果 圖2可見，待培養(yǎng)96 h后，IL-12 siRNA組、control組和negative組的A570=分別為1.014±0.037,1.132±0.030，1.147±0.023。IL-12 siRNA組膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性較control組和negative組明顯降低(F=15.211，P<0.01)，而control組和negative組的U251細胞仍具有較高的增殖活性。

2.3AO/EB染色后檢測腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率 各組至少計數(shù)200個細胞如表。IL-12 siRNA組的細胞凋亡率較negative組及control組明顯增高(均P<0.01)。見表1。

表1 AO/EB法檢測不同組別細胞凋亡率

3 討 論

RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，能夠使相應(yīng)的基因表達受到特異性抑制，具有高特異性、高效性〔3，4〕。此項基因技術(shù)在惡性腫瘤的研究中得到非常廣泛的應(yīng)用。通過RNA干擾技術(shù)高特異性的特點，能夠選擇性地抑制目的癌基因的表達，使癌細胞增殖減少或凋亡，從而達到治療的目的，在惡性腫瘤的治療中有較高的應(yīng)用價值和前景。

IL-12又叫做NK 細胞刺激因子，具有顯著抑制腫瘤細胞生長的作用。但是其的抗腫瘤應(yīng)用會給機體造成許多副作用(發(fā)熱、 惡心、嘔吐等)，人們試圖通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)解決這一問題，通過提高機體對抗瘤的免疫應(yīng)答功能，達到針對性治療腫瘤的目的〔5～7〕。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-12基因?qū)?腫瘤細胞，讓其分泌細胞因子，使細胞內(nèi)局部積聚高濃度IL-12，改變腫瘤內(nèi)部免疫微環(huán)境，更能夠促進免疫環(huán)境的激發(fā)〔8，9〕；同時可使IL-1在局部獲得持續(xù)的表達，達到維持免疫反應(yīng)的作用。經(jīng)IL-12基因修飾過后，腫瘤細胞的免疫原性得到增強，其表面某些黏附分子和組織相密性復(fù)合體(MHC)抗原的表達明顯增強，這樣機體就可以被誘導(dǎo)，從而產(chǎn)生較強免疫應(yīng)答。機體對此種經(jīng)IL-12基因轉(zhuǎn)染、修飾的腫瘤細胞的殺傷能力明顯增強。

綜上，將構(gòu)建好的IL-12 siRNA表達載體成功轉(zhuǎn)染入U251細胞，使之在U251細胞內(nèi)有效表達。IL-12基因在腦膠質(zhì)瘤增殖、凋亡過程中發(fā)揮重要作用，也為腦膠質(zhì)瘤的基因靶向治療提供了可行的辦法。

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