SALL4在結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用

馬從乾 王 雅 趙 星 楊 軻

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽 473000)

雙樹樣基因(SALL)4在維持胚胎干細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用，其激活或者抑制通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和遺傳調(diào)節(jié)器參與組織的自我更新和多功能化。在干細(xì)胞中，SALL4通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因的表達(dá)也可導(dǎo)致染色質(zhì)重塑〔1〕。SALL4與重要細(xì)胞信號通路如Wnt和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)有直接的聯(lián)系，因此，SALL4與細(xì)胞凋亡和惡性腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)〔2，3〕。SALL4調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞的分化，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中也有同樣的作用〔4〕。結(jié)直腸癌(CRC)的進(jìn)展涉及各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但是關(guān)于SALL4在CRC中的分子流行病學(xué)及SALL4的表達(dá)與CRC的關(guān)系研究還很少。本研究將探討SALL4的表達(dá)及與CRC臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南陽市中心醫(yī)院普外科2009年1月至2013年1月64例CRC患者的新鮮腫瘤組織和配對正常組織標(biāo)本，患者在術(shù)前沒有接受化療或放療。所有標(biāo)本都經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為CRC。標(biāo)本獲取均獲患者知情同意，并且臨床資料完整。

1.2主要儀器與試劑 RNAiso plus試劑，RT-PCR試劑盒、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑和PCR試劑(大連寶生物工程公司)，高通量組織破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，超凈工作臺(珠江市再鑫儀器有限公司)，離心機(jī)(Thermo Scientific公司)，PCR儀(Agilent Technologies公司)。

1.3引物設(shè)計(jì) 按照GenBank提供的SALL4基因序列(NM 020436.3)，由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成兩對目的基因引物，正義′：ATCGAGAACACCATGGCTCTG，反義′：GACTGGGAGCCATCCATCTTG。管家基因GAPDH為成品(RT-PCR Primer HS002)，直接稀釋使用。

1.4RQ-PCR檢測目的基因 (1)RNA提取：稱量100 mg組織，加入1 ml RNA iso，然后加入滅菌消毒的鋼珠經(jīng)高通量組織破碎儀破碎后劇烈振蕩，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管，加氯仿200 μl顛倒混勻，靜置5 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清后加等體積異丙醇，混勻，靜置15 min，4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清，加1 ml 75%乙醇后室溫干燥，RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，測吸光度(A)值，計(jì)算RNA含量。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：以提取的腫瘤組織、正常組織及不同梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄體系(10 μl)：模板1 μl，隨機(jī)引物0.5 μl，5×Prime Script TM緩沖液2 μl，dNTP混合液0.5 μl，Prime Script TMRTEnzyme Mix 10.5 μl，RNA ase Freed H2O 5.5 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件37℃15 min，85℃ 5 s。(3)RQ-PCR：以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，20 μl的PCR反應(yīng)體系包括SYBR Premix ExTaqI 10 μl，目的基因與管家基因的定量引物各0.8 μl，dH2O 6.4 μl，將配好的PCR反應(yīng)液每孔分裝18 μl，按順序加腫瘤組織、正常組織及不同梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA 2 μl，置于Light Cycler定量PCR擴(kuò)增儀上，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s，40個循環(huán)，95℃10 s，65℃15 s。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，分別應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和連續(xù)校正t檢驗(yàn)和單因素方差分析、直線回歸相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤組織中SALL4基因的表達(dá) SALL4在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織(P<0.05)。

2.2SALL4基因表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系 SALL4基因高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。19例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中有15例過表達(dá)SALL4(均數(shù)為8.25±1.26)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，76%患者的SALL4表達(dá)(均數(shù)為4.68 ± 3.72)。SALL4和腫瘤細(xì)胞分化程度相關(guān)。高分化組29例(78.4%)、中分化組19例(86.4%)腫瘤組織過表達(dá)SALL4(P<0.05)。SALL4的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，腫瘤浸潤深度等病理特點(diǎn)無關(guān)。相關(guān)分析顯示，SALL4過表達(dá)與性別相關(guān)(P=0.037，r=0.372)，男性SALL4表達(dá)高于女性(均數(shù)分別為6.25 ± 4.20和4.64 ± 3.54)；在腫瘤晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)，SALL4過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈負(fù)相關(guān)(P= 0.021，r=-0.437)。見表1。

表1 SALL4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性〔n(%)〕

3 討 論

SALL4作為胚胎干細(xì)胞的調(diào)控基因，在眾多惡性腫瘤都有表達(dá)，如乳腺癌和肺癌、B淋巴細(xì)胞淋巴瘤、骨髓異常增生綜合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤(GCTs)、睪丸生殖系統(tǒng)細(xì)胞腫瘤〔2～11〕。SALL4在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，特別是低分化階段，而且是生殖細(xì)胞源轉(zhuǎn)移性癌的重要特征性標(biāo)志。此外，SALL4在乳腺癌和肺癌的診斷和治療中都有重要的作用〔5，6〕，并被認(rèn)為是肝癌不良預(yù)后的一個分子，在肝癌的發(fā)生過程中起到一定的作用〔12〕。沉默腫瘤癌細(xì)胞株中SALL4基因，能夠抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔13〕。SALL4基因可被檢測，并且具有高敏感性和特異性，所以對于惡性腫瘤的診斷、評價預(yù)后和治療中有很大的價值。本研究表明SALL4高表達(dá)與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，預(yù)示著SALL4高表達(dá)是CRC不良預(yù)后的一個指標(biāo)。

在CRC樣本中，SALL4基因的高表達(dá)通過抑制凋亡前基因如磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)抑制轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存在有基礎(chǔ)性作用。與其他正常組織相比，在CRC細(xì)胞中，PTEN基因表達(dá)下調(diào)或者缺失。PTEN基因表達(dá)的缺失來源于PTEN基因家族的各種突變〔14〕。SALL4基因的下調(diào)導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，PTEN基因的激活可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生〔15〕；同時有研究〔16〕發(fā)現(xiàn)，在CRC中，PTEN基因有腫瘤抑制作用。在CRC腫瘤組織中，SALL4基因的高表達(dá)導(dǎo)致了PTEN基因的下調(diào)。因此，SALL4基因的高表達(dá)通過抑制腫瘤抑制基因PTEN的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制凋亡的發(fā)生而促進(jìn)CRC細(xì)胞的存活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

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