乙型流感病毒在不同胚齡雞胚中適宜孵育條件的研究

李孫華，靳 亮

(1.天津天士力研究院，300410，天津；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，330029，南昌)

乙型流感病毒在不同胚齡雞胚中適宜孵育條件的研究

李孫華1，靳 亮2*

(1.天津天士力研究院，300410，天津；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，330029，南昌)

為了找出乙型流感病毒毒株在不同胚齡雞胚中適宜孵育條件，提升血凝滴度，從而為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)人用3價流感疫苗提高產(chǎn)能，主要采用血凝法檢定收獲尿囊液，分析試驗血凝滴度數(shù)據(jù)，得出結(jié)論：乙型流感病毒毒株接種于10 d胚齡雞胚，其孵育溫度為35 ℃，孵育時間72 h最理想；孵育溫度和時間對乙型流感病毒的血凝滴度有影響，同時雞胚胚齡與其的血凝滴度和收獲尿囊液量也有明顯的關(guān)聯(lián)。

乙型流感病毒；雞胚；孵育；血凝滴度

0 引言

流行性感冒病毒，簡稱流感病毒(Influenza virus)，是一種造成人、狗、馬、豬及禽類等患流行性感冒的RNA病毒[1]。在病毒分類學(xué)上，流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，可分為甲型流感病毒(Influenza A virus)、乙型流感病毒(Influenza B virus)和丙型流感病毒(Influenza C virus)3個型。甲型流感病毒根據(jù)其表面(H和N)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同又可分成許多亞型；目前，甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)有15個亞型(H1～15)，神經(jīng)氨酸酶有9個亞型(N1～9)。而乙型和丙型流感病毒無亞型劃分[2-3]。目前，市售的人用3價流感病毒疫苗含有2個甲型和1個乙型病毒株的表面蛋白，因此在制備流感疫苗生產(chǎn)中都采用世界衛(wèi)生組織(WHO)年度推薦的、并經(jīng)中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的人用流感病毒毒株H1N1、H3N2、乙型3種的流感病毒毒株。而根據(jù)流感病毒的變異性，甲型流感病毒有著極強(qiáng)的變異性，乙型次之的特點(diǎn)，從而造成大多數(shù)的研究都集中在甲型流感病毒上，而缺少了對乙型流感病毒更基礎(chǔ)的研究[4-5]。

目前，國際主流在流感疫苗生產(chǎn)中都選用雞胚作為流感病毒生長基質(zhì)，但是相對于甲型流感病毒，乙型流感病毒在雞胚中復(fù)制力弱，血凝滴度低，收率差等缺點(diǎn)，直接影響到流感疫苗生產(chǎn)產(chǎn)能。本文通過對乙型流感病毒毒株接種雞胚的日胚齡、孵育時間和溫度條件的探索，獲得了乙型流感病毒毒株在雞胚中孵育的最佳條件，這將為流感疫苗產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗與方法

1.1實(shí)驗材料

B/Brisbane/60/2008由英國國家生物制品檢定所(NIBSC)提供；SPF雞胚由北京梅里亞維通實(shí)驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2試驗方法

1.2.1 溫度生長適應(yīng)性試驗 將已達(dá)11 d胚齡的SPF雞胚，雞胚氣室朝上，暫放于溫度39 ℃、相對濕度50%的中小型電腦III孵箱中。用照蛋器檢查雞胚，選出發(fā)育良好雞胚，并畫出氣室邊緣和胎位，在胚胎面與氣室交界邊緣約1 mm處并避開血管粗壯、密集處做一小點(diǎn)標(biāo)記，以作為注射點(diǎn)，接種病毒滴度為6.5(lgEID50/mL)的病毒稀釋液，每枚雞胚接種劑量為0.2 mL，接種30枚雞胚，分別放入溫度為32 ℃、33 ℃、34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃下進(jìn)行72 h孵育，采用血凝法檢定收獲尿囊液，根據(jù)血凝滴度檢測結(jié)果，確定乙型流感病毒溫度生長適應(yīng)性。

1.2.2 不同孵育時間試驗 將已達(dá)11 d胚齡的SPF雞胚，接種病毒滴度為6.5(lgEID50/mL)的病毒稀釋液，每枚雞胚接種劑量為0.2 mL，接種30枚雞胚，分為6組，在確定的孵育溫度分別進(jìn)行24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h孵育，采用血凝法檢定收獲尿囊液，根據(jù)血凝滴度檢測結(jié)果，確定乙型流感病毒理想的孵育時間。

1.2.3 不同胚齡雞胚中的表達(dá)試驗 在確定的孵育溫度和時間進(jìn)行孵育，每枚雞胚接種劑量為0.2 mL，將病毒滴度為6.5(lgEID50/mL)的病毒稀釋液接種7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d胚齡6組的雞胚中，進(jìn)行孵育，采用血凝法測定收獲尿囊液，根據(jù)血凝滴度檢定結(jié)果及收獲量，確定乙型流感病毒接種雞胚的胚齡。

1.2.4 檢定方法—血凝法 倍比稀釋：根據(jù)預(yù)測測定某一樣品血凝滴度所需的孔數(shù)，在血凝板上確定一系列孔位置并標(biāo)明，注意這一系列孔必須在同一塊血凝板上。向這一系列孔中的第1孔加入0.45 mL無菌氯化鈉溶液，其它孔均加0.25 mL無菌氯化鈉溶液。吸取0.05 mL供試品加入第1孔中，輕輕吸吹混勻，吸出0.25 mL置第2孔中，再吸吹混勻后吸出0.25 mL置第3孔中，以相同方式稀釋至最后一孔，最后一孔棄掉0.25 mL。于每孔中加入0.25 mL雞血紅細(xì)胞懸液，包括樣品孔和陰性對照孔。輕輕震動血凝板使每個孔內(nèi)液體混勻后，室溫下靜置30-40 min即可記錄。

結(jié)果記錄：細(xì)血凝每孔均記錄血細(xì)胞沉集結(jié)果，以++++、+++、++、+、-表示之。一層紅細(xì)胞均勻地鋪于孔上者為++++；基本同上，但邊緣不整齊，鋪的面積稍小些者為+++；紅細(xì)胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++；紅細(xì)胞形成一個小團(tuán)，但邊緣不光滑，四周有小凝集塊者為+；紅細(xì)胞于孔底形成一個小團(tuán)，邊緣光滑并有立體感，四周無小凝集塊者為-。血凝滴度計算：系列中有++孔，以稀釋倍數(shù)最小的為滴定終點(diǎn)，滴度為該孔稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1溫度生長適應(yīng)性

將接種乙型流感病毒的SPF雞胚，放入不同溫度下進(jìn)行72 h孵育，采用血凝法檢定收獲尿囊液，根據(jù)血凝滴度結(jié)果，確定乙型流感病毒最佳孵育溫度。結(jié)果見表1。

從表1可知，不同溫度下孵育，平均血凝滴度有明顯的變化。孵育溫度32 ℃的平均血凝滴度為1:88，值最小，然后隨溫度升高，血凝滴度值也隨之升高，孵育溫度35 ℃的平均血凝滴度達(dá)到最高值，結(jié)果為1:384，然后隨著溫度升高，血凝滴度反而降低。因此，確定乙型流感病毒最佳孵育溫度為35 ℃。

表1 不同孵育溫度的血凝滴度

2.2不同孵育時間

將接種乙型流感病毒的SPF雞胚，放入35 ℃的孵化箱中，進(jìn)行不同時間孵育，采用血凝法檢定收獲尿囊液，根據(jù)血凝滴度結(jié)果，確定乙型流感病毒最理想的孵育時間。結(jié)果見表2。

表2 不同收獲時間的血凝滴度

從表2可知，24 h時收獲，血凝滴度最低，平均值為1:18；孵育36 h、48 h、60 h，血凝滴度不理想，沒有達(dá)到最高值；72 h的血凝滴度整體穩(wěn)定，達(dá)到最高值，84 h的血凝滴度有微小的回落。因此，確定乙型流感病毒最佳孵育時間為72 h。

2.3不同胚齡雞胚中的表達(dá)

在最優(yōu)的孵育溫度和時間條件下進(jìn)行孵育，每枚雞胚接種劑量為0.2 mL，將病毒稀釋液接種不同胚齡6組的SPF雞胚中，放入35 ℃的孵化箱中，進(jìn)行72 h孵育，采用血凝法檢定收獲尿囊液，并且測定收獲尿囊液體積，根據(jù)血凝滴度檢測結(jié)果及收獲量，確定乙型流感病毒接種最合適胚齡的雞胚。結(jié)果見表3。

表3 不同胚齡雞胚的血凝滴度及收獲量

從表3可知，接種胚齡7 d的雞胚時，血凝滴度最低，均值為1:100；然后隨接種胚齡增加，血凝滴度也隨之升高，接種胚齡10 d的均值達(dá)到最高值，結(jié)果為1:528；11 d、12 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。另外，從尿囊液收獲量來看，接種胚齡7 d的雞胚時，收獲量不理想，均值為7.2 mL；然后隨接種胚齡增加，收獲量也隨之增加，接種胚齡10 d的均值達(dá)到最高值，結(jié)果為10.4 mL；隨后，收獲量急劇下降，接種胚齡12 d的均值只有1.9 mL。結(jié)合血凝滴度和尿囊液收獲量，認(rèn)為乙型流感病毒接種10 d胚齡的雞胚最合適。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，雞胚病毒增殖受孵育條件、雞胚質(zhì)量、接種技術(shù)等因素的影響[6]。不同病毒的增殖有不同的孵育條件，同一種病毒接種不同胚齡的雞胚所獲得的病毒量也不同[7]。在本試驗條件下，通過血凝滴度檢測結(jié)果分析可以得到：不同溫度下孵育，對乙型流感病毒的復(fù)制力有著明顯的影響。孵育溫度越低或越高都不利于乙型流感病毒的復(fù)制，理想的孵育溫度有利于乙型流感病毒的復(fù)制，提升血凝滴度，從而提高收率。乙型流感性感冒病毒在雞胚培養(yǎng)的溫度，各國學(xué)者曾作過研究[8-9]，認(rèn)為35 ℃結(jié)果最好。本試驗結(jié)果也表明，35 ℃為乙型流感病毒最佳孵育溫度。

眾所周知，不同病毒，其復(fù)制周期也不相同。乙型流感病毒的復(fù)制增殖需要一定的時間，才能增殖到高峰，如果孵育時間不夠，病毒沒有大量釋放，造成血凝滴度不理想，同時考慮到如果孵育時間過長，雖然血凝滴度高且穩(wěn)定，但會直接影響整個工藝的進(jìn)度，因此找出最佳的孵育時間，有利于縮短制備工藝的周期，節(jié)約時間和成本，又能提高產(chǎn)能效率。試驗結(jié)果得到，72 h為乙型流感病毒最佳孵育時間，與文獻(xiàn)報道[10]，72 h后收獲病毒結(jié)果最好相一致。

根據(jù)文獻(xiàn)報道關(guān)于病毒增殖接種9-11 d胚齡的雞胚為好[11]?？紤]到雞胚中的尿囊液量的多少直接影響著疫苗生產(chǎn)的數(shù)量和經(jīng)濟(jì)效益，不同胚齡的雞胚中尿囊液量有差別。因此，在確定最佳孵育溫度和時間后，通過本試驗結(jié)果表明：接種胚齡小的雞胚，尿囊液收獲量不理想；接種胚齡大的雞胚，尿囊液收獲量很少；接種10-11 d胚齡的雞胚，獲得最大的尿囊液量，結(jié)果總體與文獻(xiàn)報道相一致。同時考慮到血凝滴度結(jié)果也得比較理想，乙型流感病毒接種10 d胚齡的雞胚最合適。

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StudyingofAppropriateIncubationConditionsofInfluenzaBVirusinDifferentEmbryonicChickenEmbryos

LI Sunhua1,JIN Liang2*

(1.Tianjin Tasly Institute,300410,Tianjin,PRC;2.Jiangxi Academy of Sciences.Institute of Microbiology,330029,Nanchang,PRC)

The appropriate incubation conditions of influenza B virus in different embryonic chicken were studied by hemagglutination assay of allantoic fluid analysis test and hemagglutination titers.The results showed that the best incubation temperature was 35 ℃ and the best incubation time was 72 h when influenza B virus strains were inoculated into 10-days-old chicken embryos. Incubation temperature and time contacted with the hemagglutination titers of influenza B virus.Furthermore,the embryo age was significantly related to the hemagglutination titer and harvest allantoic fluid.

influenza B virus;chicken embryos;culture;hemagglutination titer

2014-07-02;

2014-08-01

李孫華(1979-)，男，廣西玉林人，本科，從事生物制品質(zhì)量管理工作。

國家自然科學(xué)基金項目(31260031)。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.05.014

S852.65

A

1001-3679(2014)05-0636-04

*通訊作者：靳 亮(1979-)，山東新泰人，博士，從事昆蟲病毒分子生物學(xué)研究及生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化推廣工作。