Biglycan及血管內(nèi)皮生長因子對結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響及機制

邢曉靜 谷小虎 馬天飛

(遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤防治辦公室，*胃腸外科，遼寧沈陽 110042)

結(jié)腸癌是全球常見的惡性腫瘤。在歐美國家，結(jié)腸癌的致死率位居惡性腫瘤的第2位，結(jié)腸癌的發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1-2]。biglycan是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族(small leucine-rich proteoglycans，SLRPs)的成員，也是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的組成部分[3]。近年來的研究[4-7]表明，biglycan基因在多種腫瘤組織中高表達，例如肝癌、卵巢癌、牙源性腺樣癌。我們的前期研究[6]表明，biglycan在結(jié)腸癌中高表達，且與結(jié)腸癌的低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移正相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要轉(zhuǎn)移途徑，新生血管的形成又是腫瘤血行轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在多種血管生長因子中起中心調(diào)控作用。本研究在結(jié)腸癌細胞系HCT116中轉(zhuǎn)染biglycan cDNA和VEGF siRNA，企圖從遷移、侵襲方面探討biglycan及VEGF對結(jié)腸癌細胞的影響及機制，以期為治療結(jié)腸癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細胞株與試劑 結(jié)腸癌細胞系HCT116購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，VEGF siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自遼寧省沈陽萬類生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，引物由生工生物(上海)有限公司合成，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞生長至80%～90%融合時進行傳代。

1.3 實驗分組和細胞轉(zhuǎn)染 實驗設(shè)置未轉(zhuǎn)染對照組(mock組)、空載質(zhì)粒和非特異性干擾片段轉(zhuǎn)染組(vector+siRNA-NC組)、biglycan cDNA和非特異性干擾片段轉(zhuǎn)染組(biglycan+siRNA-NC組)以及biglycan cDNA和VEGF siRNA共轉(zhuǎn)染組(biglycan+siRNA-VEGF組)。本實驗室前期已經(jīng)成功構(gòu)建biglycan穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116細胞系。VEGF siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，反義鏈：5′-AAAGUAGUGCUUCACCACUUC-3′，正義鏈：5′-UCAUCACGAAGUGGUGAAGAA-3′，陰性對照由該公司配套提供。轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰蛋白酶消化并接種于6孔培養(yǎng)板，之后按Lipofectamine 2000說明書操作，將siRNA-NC及siRNA-VEGF片段按實驗分組轉(zhuǎn)染至對應(yīng)細胞中，干擾片段轉(zhuǎn)染量為160 pmol/孔。

1.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測biglycan、VEGF mRNA的表達 采用Trizol法提取各組細胞的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參照，進行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)。biglycan的上、下游引物序列為：5′-GGTCTCCAGCACCTCTACGCC-3′，5′-AACACTCCCTTGGGCACCTT-3′，擴增片段長度203 bp；VEGF的上、下游引物序列為：5′-CCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACT-3′，5′-CTCGGTGATTTAGCAGCAAGA-3′，擴增片段長度105 bp；β-actin的上、下游引物序列為：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，擴增片段長度為156 bp。參照2×Taq PCR Master Mix試劑盒說明書，在反應(yīng)管中加入cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，最后加入雙蒸水(double distilled water，ddH2O)補足總體積至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)將圖片掃描入電腦并采用GelPro4.0軟件對電泳結(jié)果進行灰度分析。

1.5 劃痕實驗檢測遷移能力 取對數(shù)生長期的各組細胞，胰酶消化后接種于6孔板。待細胞完全貼壁后用200 μL滅菌槍頭在6孔板底部單層細胞的中央劃一道痕，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細胞后在顯微鏡下攝影。加入細胞培養(yǎng)液后于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細胞生長情況并用顯微鏡攝影，用Image-Pro Plus軟件分別測量處理前后細胞劃痕邊界的距離，計算遷移率。

1.6 Transwell實驗檢測侵襲能力 將Matrigel膠4 ℃過夜以解凍，用無血清培養(yǎng)基將Matrigel膠在冰上按1∶2稀釋。將Transwell小室放入24孔板中，用50 μL預(yù)先稀釋好的Matrigel膠包被小室膜，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h，使Matrigel膠凝固。各組細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后稀釋至密度為5×104個/mL的細胞懸液。將處理后的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20% FBS的培養(yǎng)液800 μL，上室加入細胞懸液200 μL，使細胞數(shù)達1×104個/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用PBS輕輕沖洗，用棉簽擦去微孔膜上層細胞，在多聚甲醛中室溫固定20 min，蘇木素染液染色7 min，蒸餾水沖洗。在倒置顯微鏡下(200×)計數(shù)遷移至微孔膜下層的細胞。每個樣本選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，取均數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測SNAIL、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白質(zhì)，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取40 μg總蛋白，經(jīng)10%分離膠、5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜；用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入含SNAIL、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9的一抗封閉液，置于4 ℃搖床，過夜；PBS洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；將膜與電化學(xué)發(fā)光液靜置反應(yīng)5 min，轉(zhuǎn)入暗盒中，在暗室進行曝光。獨立實驗重復(fù)3次。

1.8 明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9活性 轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞，提取總蛋白質(zhì)，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。加入非還原型電泳緩沖液后，用含有1%明膠底物的8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，用2.5% TritonX-100室溫洗滌30 min，轉(zhuǎn)移至底物消化緩沖液中，37 ℃過夜。固定2 h后，用考馬斯亮藍染色20 min，脫色直至出現(xiàn)清晰的條帶，對電泳結(jié)果進行圖像掃描分析。

2 結(jié) 果

2.1 biglycan、VEGF mRNA的表達 biglycan+siRNA-NC組和biglycan+siRNA-VEGF組biglycan mRNA的表達水平均顯著高于mock組及vector+siRNA-NC組(P<0.05)；biglycan+siRNA-NC組VEGF mRNA的表達水平顯著高于mock組和vector+siRNA-NC組(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF組VEGF mRNA的表達水平顯著低于biglycan+siRNA-NC組(P<0.05)。見圖1。

2.2 遷移能力的檢測結(jié)果 與mock組及vector+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-NC組細胞明顯從劃痕邊緣向劃痕內(nèi)遷移，細胞遷移能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF組與biglycan+siRNA-NC組比較，細胞遷移能力顯著下降(P<0.05)。見圖2～3。

2.3 侵襲能力的檢測結(jié)果 與mock組及vector+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-NC組細胞侵襲能力顯著提高(P<0.05)；biglycan+siRNA-VEGF組與biglycan+siRNA-NC組比較，細胞侵襲能力明顯下降(P<0.05)。見圖4～5。

2.4 Western blotting法檢測結(jié)果 與mock組和vector+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-NC組MMP-2、MMP-9、vimentin、SNAIL蛋白的表達水平顯著升高，E-cadherin蛋白的表達水平則顯著降低(P<0.05)；與biglycan+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-VEGF組MMP-2、MMP-9、vimentin、SNAIL蛋白的表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達水平則顯著提高(P<0.05)。見圖6～7。

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

A、B、C、D分別為mock組、vector+siRNA-NC組、biglycan+siRNA-NC組、biglycan+siRNA-VEGF組劃痕后0 h結(jié)果；a、b、c、d分別為相應(yīng)組劃痕后培養(yǎng)24 h結(jié)果

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

A、B、C、D分別為mock組、vector+siRNA-NC組、biglycan+siRNA-NC組、biglycan+siRNA-VEGF組

2.5 明膠酶譜法的檢測結(jié)果 與mock組及vector+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-NC組MMP-2及MMP-9的活性明顯增加(P<0.05)；而與biglycan+siRNA-NC組比較，biglycan+siRNA-VEGF組MMP-2及MMP-9的活性顯著下降(P<0.05)。見圖8。

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

與mock組比較，aP<0.05；與vector+siRNA-NC組比較，bP<0.05；與biglycan+siRNA-NC組比較，cP<0.05

3 討 論

結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌病死的主要原因之一[8]。腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，侵入到ECM，通過基底膜細胞間質(zhì)中的一些黏附分子激活基底膜細胞，并促使其合成和分泌各種降解酶；腫瘤細胞在這些酶的協(xié)助下進入血管，在某些因子作用下運行并穿過血管壁滲到繼發(fā)部位，形成轉(zhuǎn)移灶[9]。

biglycan是一種重要的ECM組成成分，是SLRPs家族成員之一。biglycan通過與轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、膠原分子以及其他基質(zhì)因子相結(jié)合，參與ECM的聚集、細胞遷移與細胞黏附[10]。研究[11-12]表明，biglycan與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系，已經(jīng)成為多種腫瘤的標(biāo)志物。biglycan在腫瘤的遷移、侵襲中也發(fā)揮重要作用。研究[13]顯示，biglycan在腫瘤血管內(nèi)皮中的表達水平高于正常組織，下調(diào)biglycan的表達可抑制細胞的遷移能力。研究[14]顯示，過表達biglycan可提高胃癌細胞的血管侵襲能力，且biglycan高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)；biglycan高表達的患者腫瘤復(fù)發(fā)率高、生存期短。在本研究中，當(dāng)過表達biglycan時，劃痕實驗和Transwell實驗顯示，結(jié)腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲能力顯著增強，與已有的研究[14]結(jié)果一致；當(dāng)過表達biglycan的同時下調(diào)VEGF時，biglycan促進腫瘤遷移和侵襲的作用則受到抑制。

vimentin是間質(zhì)細胞標(biāo)志因子，它的過表達標(biāo)志著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，即啟動了腫瘤轉(zhuǎn)移。E-cadherin是一類介導(dǎo)同種細胞互相黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，參與形成和維護正常細胞間的聯(lián)結(jié)，是介導(dǎo)細胞間連接最重要的一類分子。SNAIL是E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制子[15]。MMP-2和MMP-9在腫瘤細胞從腫瘤組織脫離及進入轉(zhuǎn)移部位的過程中發(fā)揮重要作用，它們共同參與降解ECM大分子[16]。本研究中，當(dāng)biglycan過表達時，VEGF的表達水平顯著提高，介導(dǎo)細胞間連接的E-cadherin表達水平降低，而具有降解ECM作用的MMP-2、MMP-9、vimentin以及E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制子SNAIL的表達水平均顯著提高，MMP-2和MMP-9的活性顯著升高。以上結(jié)果說明，biglycan的過表達能促進VEGF的表達并能增強HCT116細胞的遷移和侵襲。當(dāng)biglycan過表達的同時，又干擾下調(diào)VEGF的表達時，上述與細胞遷移、侵襲相關(guān)的因子的表達水平均發(fā)生逆向的變化，MMP-2和MMP-9的活性也顯著降低；這說明，干擾VEGF的表達可抑制biglycan對HCT116細胞遷移、侵襲的促進作用。

綜上所述，biglycan通過促進VEGF的表達來促進結(jié)腸癌細胞HCT116的遷移和侵襲，下調(diào)VEGF的表達可逆轉(zhuǎn)biglycan對HCT116細胞遷移和侵襲的促進作用。

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