響應(yīng)面分析法優(yōu)化腸桿菌的發(fā)酵條件生產(chǎn)殼聚糖酶

程仕偉1，孫少華1，張 盈1，陶春彥1，朱 琳1，姜國(guó)正

(1．魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所，山東 煙臺(tái) 264025；2. 煙臺(tái)恒源生物股份有限公司，山東 煙臺(tái) 265709)

殼聚糖是由2-氨基-D-葡萄糖和2-乙酰氨基-D-葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的多糖，與甲殼素、殼寡糖均被稱(chēng)為甲殼素類(lèi)物質(zhì)，被譽(yù)為繼糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等生命元素之外的第6大生命物質(zhì)[1]。殼聚糖經(jīng)降解后得到的殼寡糖與殼聚糖相比具有良好的水溶性，易被機(jī)體吸收，且具有許多獨(dú)特的生理活性[2]，其商業(yè)產(chǎn)品涉及功能性食品、藥品、環(huán)保、化工等多個(gè)領(lǐng)域[3-5]。殼寡糖的制備可采用化學(xué)法和酶降解法，通過(guò)化學(xué)方法降解殼聚糖制備殼寡糖的方法具有污染環(huán)境、產(chǎn)物不均一等缺點(diǎn)[6]。與常用的化學(xué)降解法相比，酶降解法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和且易控制，產(chǎn)品得率高、功能性強(qiáng)，不會(huì)造成環(huán)境污染，是殼寡糖制備的主要方法[7-8]。

殼聚糖酶(Chitosanase, EC 3.2.1.132)是一類(lèi)可專(zhuān)一性催化殼聚糖的β-1,4-糖苷鍵斷裂，制備低分子量殼寡糖的糖苷水解酶[9]，已發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶主要屬于糖基水解酶家族8、46 75、80等，廣泛存在于微生物中，在植物組織中也有分布[10]。殼聚糖酶根據(jù)其作用位點(diǎn)不同，可分為3類(lèi)：1)水解 GlcN-GlcN 鍵及 GlcNAc-G1cN 鍵；2)只能水解 G1cN-GlcN 鍵；3)既可水解G1cN-GlcN 鍵又可水解 G1cN-GlcNAc 鍵。所有殼聚糖酶有一個(gè)共同催化性質(zhì)就是要求糖苷鍵的一側(cè)至少有1個(gè)G1cN 殘基，而不能催化 GlcNAc-G1cNAc鍵的斷裂[2, 11]。不同生物來(lái)源殼聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成產(chǎn)物殼寡糖聚合度存在差異[12]。選育產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株, 并優(yōu)化酶產(chǎn)量對(duì)合成不同聚合度產(chǎn)品具有積極意義。本文對(duì)研究室選育的產(chǎn)殼聚糖酶腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，旨在為殼聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌(Enterobactersp.)YT21，為本研究室從新鮮蝦皮組織中分離鑒定并保存。3, 5-二硝基水楊酸購(gòu)自BBI公司，85%脫乙酰度的殼聚糖購(gòu)自濟(jì)南海得貝生物工程有限公司，其余試劑均為分析純或生物純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)，蘇州安泰；H1850R離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器；HZQ-Q全溫?fù)u床，哈爾濱東聯(lián)；SPX-250BS生化培養(yǎng)箱，上海新苗。

1.3 菌種活化

培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 5，酵母粉 3，蛋白胨 10，MgSO4.7H2O 2，pH 7.0。121 ℃滅菌15 min，將斜面保藏菌種挑一環(huán)轉(zhuǎn)接50 mL滅菌培養(yǎng)基，在30 ℃和200 r/min下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶，培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖 12、 酵母粉 8、 KCl 4、粉末殼聚糖 0.5、 NH4Cl 8、 MgSO4·7H2O 4、 MnSO44、 NaCl 2、粉末殼聚糖 0.5、pH 7.0。在不同溫度、pH和接種量條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)36 h后測(cè)定殼聚糖酶活力。

1.5 響應(yīng)面分析優(yōu)化

根據(jù)單因素優(yōu)化的結(jié)果，利用Design-Expert軟件分別對(duì)培養(yǎng)溫度、pH和接種量這3個(gè)因素進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)組，其中中心點(diǎn)試驗(yàn)5次用于估計(jì)試驗(yàn)誤差，其余組為析因組。以殼聚糖酶活性為響應(yīng)值，確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.6 殼聚糖酶活性測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取適當(dāng)稀釋度的上清液1 mL，加入1 mL的1% (m/V) 底物水浴(40 ℃)保溫20 min，加DNS試劑3 mL，沸水浴5 min，定容至25 mL后取4 mL反應(yīng)樣液在5000 r/min下離心10 min。取離心后上清液以對(duì)照組作為空白在520 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其酶活力。空白對(duì)照組：相同稀釋度的發(fā)酵上清液1 mL，沸水浴5 min滅活，再加入相同體積的殼聚糖溶液和DNS，處理方法同樣品組。以單位體積(mL)單位時(shí)間(min)水解產(chǎn)生的氨基葡萄糖的μmol數(shù)為酶活力的定義單位[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化培養(yǎng)基，產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌在pH 7.0、4% (V/V)接種量和200 r/min條件下，考察培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，發(fā)酵36 h后測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，菌株在28～35 ℃的溫度區(qū)間均有較好的產(chǎn)殼聚糖酶能力，最佳培養(yǎng)溫度為32 ℃，產(chǎn)酶量為7.32 U/mL。當(dāng)溫度低于28 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致殼聚糖酶的產(chǎn)量低。相反的，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)過(guò)快而導(dǎo)致酶產(chǎn)量較低。

圖1 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.2 培養(yǎng)pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在4% (V/V)接種量、32℃和200 r/min條件下，研究pH對(duì)腸桿菌YT21產(chǎn)殼聚糖酶的影響，發(fā)酵36 h后測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，菌株對(duì)pH的適應(yīng)性較強(qiáng)，在pH 5.5～7.5區(qū)間均有較好的殼聚糖酶生產(chǎn)能力，其中在pH 6.0時(shí)獲得最大產(chǎn)酶量，活性值為8.22 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)基pH低于5.5或高于7.5時(shí)均不利于殼聚糖酶的分泌表達(dá)。

圖2 pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.3 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在pH 6.0、32 ℃和200 r/min條件下，研究接種量對(duì)腸桿菌YT21產(chǎn)殼聚糖酶的影響，發(fā)酵36 h后測(cè)定酶活力。由圖3可以看出，菌株在6%～12% (V/V)的接種量時(shí)獲得較大的酶活性，其中8% (V/V)接種量時(shí)獲得最大殼聚糖酶活性，為10.73 U/mL。當(dāng)接種量低于6%時(shí)，由于接種量不足導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)從而殼聚糖酶活力低。由圖3還可看出，當(dāng)接種量高于8%時(shí)，發(fā)酵測(cè)定的酶活力變化不大，顯示最佳接種量為8%。

圖3 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，對(duì)培養(yǎng)溫度、pH和接種量進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]，因素水平編碼見(jiàn)表1。將培養(yǎng)溫度(A)、pH(B)和接種量(C)3個(gè)因素作為自變量，以殼聚糖酶活性(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17個(gè)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中5個(gè)為中心試驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用DesignExpert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。培養(yǎng)溫度(A)、pH(B)和接種量(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：殼聚糖酶活性(U/mL) =11.69 + 0.05A+ 1.30B- 1.24C-0.18AB+ 0.62AC+ 0.02BC-2.07A2+0.42B2-1.71C2，其中一次項(xiàng)B、C極顯著(P< 0.01)，二次項(xiàng)A2、C2極顯著(P< 0.01)(表3)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

注：差異顯著(P< 0.05)；差異極顯著(P< 0.01)。

根據(jù)表3可以得出，回歸模型的F=7.58，其P=0.007，表明該模型極為顯著，決定系數(shù)R2=0.907 0，表明回歸模型與實(shí)際情況擬合性良好，可以用于發(fā)酵條件優(yōu)化。失擬項(xiàng)P=0.1189>0.05，即模型失擬不顯著，說(shuō)明該方程可以很好地描述各發(fā)酵條件和殼聚糖酶活性的關(guān)系。各項(xiàng)P值小于0.05時(shí)，說(shuō)明其對(duì)模型作用顯著，由P值大小可知，在所選各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的影響大小分別為培養(yǎng)pH>接種量>培養(yǎng)溫度。信噪比>4是可取的，本模型中為9.655，模擬效果較好。

圖4 培養(yǎng)溫度和pH交互作用對(duì)殼聚糖酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用軟件做培養(yǎng)溫度、pH和接種量對(duì)殼聚糖酶活性產(chǎn)生影響的響應(yīng)面圖(分別見(jiàn)圖4、圖5和圖6)，以分析2個(gè)因素的交互作用對(duì)殼聚糖酶活性的影響。根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度31.74 ℃、pH 6.5和接種量為7.26% (V/V)，模型模擬的理論殼聚糖酶最高活性值為13.65 U/mL。

圖5 培養(yǎng)溫度和接種量交互作用對(duì)殼聚糖酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

圖6 培養(yǎng)pH和接種量交互作用對(duì)纖維素酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 回歸模型驗(yàn)證與發(fā)酵培養(yǎng)曲線

為檢驗(yàn)方法的可靠性，采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶實(shí)驗(yàn)，其培養(yǎng)曲線見(jiàn)圖7。

圖7 菌株發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)曲線

發(fā)酵36 h后實(shí)際得到的殼聚糖酶活性值為13.59 U/mL，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的誤差約為0.43%。因此采用響應(yīng)面優(yōu)化腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶條件可靠，具有實(shí)用價(jià)值。由圖7可看出，殼聚糖酶產(chǎn)量與菌體量呈現(xiàn)不完全對(duì)應(yīng)關(guān)系，最大生物量出現(xiàn)在發(fā)酵30 h，隨后經(jīng)短暫靜止期后進(jìn)入衰退期。腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶屬于部分生長(zhǎng)耦聯(lián)型(延續(xù)合成型)， 即酶的合成隨著細(xì)胞生長(zhǎng)量的增加而增加， 在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)時(shí)間，在發(fā)酵48 h時(shí)獲得最大殼聚糖酶活性，為17.82 U/mL。綜上可判定，該酶為誘導(dǎo)酶，一般不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏，所對(duì)應(yīng)的mRNA相對(duì)穩(wěn)定，屬于理想的產(chǎn)酶類(lèi)型，具有深入研究的潛力。

3 結(jié)論

首先對(duì)腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)溫度、pH和接種量進(jìn)行優(yōu)化，確立中心位點(diǎn)后進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度31.74℃、pH6.5和7.26%(V/V)接種量，培養(yǎng)48h獲得的最大殼聚糖酶活性為17.82U/mL，殼聚糖酶的生產(chǎn)方式為延續(xù)合成型，具有深入優(yōu)化并規(guī)模生產(chǎn)的潛力，相關(guān)酶學(xué)特性與深入優(yōu)化研究正在進(jìn)行。

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