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    大鼠彌漫性腦損傷后腦源性及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子時(shí)序性表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

    2014-09-03 16:36:37陳梅花陳貴珍賈萬
    中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2014年19期
    關(guān)鍵詞:彌漫性腦損傷膠質(zhì)

    陳梅花++++++陳貴珍++++++賈萬鈞++++++孫汝亮++++++胡丙杰

    [摘要] 目的 探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在大鼠腦組織中的表達(dá)水平隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律,以期為腦損傷時(shí)間的推斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 將90只無特定病原體(SPF)SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)及實(shí)驗(yàn)組(n=80),對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型,并根據(jù)傷后時(shí)間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組,每組各10只。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠腦組織中GDNF和BDNF表達(dá),比較各組大鼠腦組織不同部位及損傷時(shí)間GDNF、BDNF的表達(dá)和變化規(guī)律。 結(jié)果 大腦、小腦、腦干組織中GDNF和BDNF陽性信號(hào)灰度在損傷后1 h組表達(dá)升高,6 h組達(dá)最高峰,12 h組開始回落;1、3、6、12、24、48、72、120 h組大腦、小腦、腦干組織中GDNF陽性信號(hào)灰度值均顯著高于正常對(duì)照組(P < 0.05),各組各部位陽性信號(hào)面積密度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 結(jié)論 BDNF、GDNF可以作為大鼠彌漫性腦損傷后經(jīng)過時(shí)間推斷的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

    [關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;免疫組織化學(xué);圖像分析

    [中圖分類號(hào)] R651.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2014)07(a)-0017-04

    顱腦損傷時(shí)間的推斷是法醫(yī)病理工作者一直致力解決的問題。目前尚未找到可應(yīng)用于法醫(yī)檢案的切實(shí)可行的生物學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用改良大鼠彌漫性腦損傷模型[1],應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析法探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line derived neuro trophic factor,GDNF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在彌漫性腦損傷腦組織不同部位的表達(dá)水平隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律及其相關(guān)性,以期為尋找腦損傷時(shí)間推斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    SPF級(jí)SD大鼠90只由中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(粵)2007-2008],雄雌不限,體重:(250±10)g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)及實(shí)驗(yàn)組(n=80),對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型,并根據(jù)傷后時(shí)間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組,每組各10只。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

    免疫組織化學(xué)試劑兔抗鼠GDNF一抗來自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology Inc公司;兔抗鼠BDNF一抗來自武漢博士德公司;SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均來自福建麥新公司。病理圖像分析采用中山大學(xué)法醫(yī)系YC.TY-2050型法醫(yī)病理圖像分析系統(tǒng),定量測(cè)量(灰度域0~256,0為白,放大倍數(shù)200×)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 取材及處理 參照本研究組前期改良大鼠彌漫性腦損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒1]的實(shí)驗(yàn)方法,并用本研究前期自制的打擊裝置對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠造成腦損傷。實(shí)驗(yàn)組按時(shí)間段分別用2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉斷頸取完整腦組織(圖1、2);正常對(duì)照組大鼠麻醉后斷頸取腦。所有取材均用10%甲醛固定72 h,在大腦正中外側(cè)1~2 mm處作矢狀切面,同一切面取大腦、小腦、腦干3個(gè)部位,取材厚度約5 mm,石蠟包埋,切片厚度約2 μm,分別進(jìn)行常規(guī)HE染色。

    1.3.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 常規(guī)脫臘至水,采用高壓修復(fù)抗原的方法,蒸餾水沖洗3 min×2次;3%H2O2室溫處理20 min;PBS緩沖液沖洗3 min×3次;血清封閉37℃水浴10 min;加入一抗(1∶200工作濃度),4℃冰箱過夜;4℃冰箱取出室溫放置10 min后,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;加入二抗,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;加入鏈酶菌抗生素蛋白-辣根過氧化物酶復(fù)合物,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

    1.3.3 圖像分析 每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,分別測(cè)量GDNF、BDNF陽性反應(yīng)物面積密度、灰度值。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HE染色結(jié)果分析

    腦組織損傷呈全腦局部彌漫性分布,有出血、神經(jīng)細(xì)胞腫脹、膠質(zhì)細(xì)胞嗜酸性變、腦組織疏松、神經(jīng)細(xì)胞變性壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象。在1、3 h 組出血改變較為明顯,其他改變沒有時(shí)間上的特異性分布。見圖3、4。

    2.2 GDNF、BDNF免疫組化染色

    GDNF、GDNF陽性結(jié)果為棕褐色,以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照,未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有染為棕褐色顆粒。正常對(duì)照組可見大腦、腦干、小腦分子層細(xì)胞有散在GDNF、BDNF弱陽性反應(yīng),小腦浦肯野細(xì)胞有強(qiáng)陽性反應(yīng),陽性信號(hào)主要位于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)各組陽性信號(hào)表達(dá)部位與正常對(duì)照組相同,陽性信號(hào)的面積密度無明顯變化,陽性著色明顯加深(圖5,封三)。

    2.3 免疫組化染色結(jié)果分析

    表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)圖像分析,測(cè)量陽性信號(hào)灰度值及面積密度值,做統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示:與正常對(duì)照組比較,1 h組GDNF信號(hào)灰度值開始增高(P < 0.05),3 h組表達(dá)增強(qiáng)到最高峰,12 h組有所回落,但仍高于正常對(duì)照組(P < 0.05),此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組。1、3、6、12、24、48、72、120 h組強(qiáng)度均顯著高于正常對(duì)照組水平(P < 0.05);各組陽性信號(hào)面積密度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表1。

    BDNF陽性信號(hào)灰度在損傷后1 h表達(dá)升高,6 h達(dá)最高峰,12 h開始回落,24 h回落到正常水平。各組陽性信號(hào)面積密度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表2。

    3 討論

    GDNF對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)和修復(fù)的作用[2-4],在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)彌漫性腦損傷后GDNF表達(dá)水平上升,這種上升是機(jī)體對(duì)腦的保護(hù)性反應(yīng)[5],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦損傷后GDNF表達(dá)水平升高迅速且靈敏,在1 h即具有顯著性;GDNF在腦損傷表達(dá)水平增高呈現(xiàn)與時(shí)間變化相關(guān)規(guī)律,損傷1 h GDNF陽性表達(dá)開始增高,3 h表達(dá)增強(qiáng)到最高峰,12 h有所回落,但仍高于正常對(duì)照組,此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組,此外,大腦、小腦、腦干部位GDNF表達(dá)上調(diào)時(shí)間基本一致,符合腦損傷彌漫性分布的特點(diǎn)。

    理論上,由于GDNF在神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)[6-7],而腦損傷后兩種細(xì)胞的反應(yīng)程度和反應(yīng)時(shí)間不同[8],本研究期望在腦損傷后GDNF表達(dá)變化趨勢(shì)圖出現(xiàn)兩個(gè)高峰:神經(jīng)細(xì)胞引起的GDNF表達(dá)高峰和膠質(zhì)細(xì)胞引起的GDNF的表達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)只觀察到在3 h的表達(dá)高峰,可能是因?yàn)槟z質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)一直持續(xù)到120 h后,使得GDNF二次表達(dá)高峰延續(xù)到120 h后,在本實(shí)驗(yàn)中由于受選取時(shí)間點(diǎn)限制,沒有反映這一規(guī)律;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)高峰出現(xiàn)在3 h,與王欣等[9]及陳寶友等[10]的研究結(jié)果不一致,這種不一致可能是損傷程度不同造成的。Wetmore等[11]的研究揭示神經(jīng)細(xì)胞有低水平BDNF mRNA表達(dá),Sinson等[12]、Mocchetti等[13]及Wang等[14]分別在對(duì)缺血缺氧性腦損傷的研究中揭示BDNF對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用。董吉容等[15]報(bào)道大鼠液壓腦損傷后BDNF mRNA表達(dá)呈一定的時(shí)序變化。BDNF在局部彌漫性腦損傷后表達(dá)變化規(guī)律目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道,本研究對(duì)這一問題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。綜合前人的研究結(jié)果,本研究選擇BDNF作為研究指標(biāo)具有下列理由:①選取指標(biāo)具特異性,在正常腦組織中有表達(dá)在腦損傷后表達(dá)水平特異性改變;②對(duì)腦損傷的反應(yīng)具有敏感性,損傷后短時(shí)間內(nèi)表達(dá)水平即有改變;③腦損傷后表達(dá)水平變化呈一定的規(guī)律。本研究結(jié)果顯示,正常對(duì)照組大鼠BDNF弱陽性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組BDNF蛋白表達(dá)水平呈明顯的時(shí)序性規(guī)律。由于本研究動(dòng)物模型腦損傷彌漫性分布的特點(diǎn),對(duì)彌漫性腦損傷后大鼠腦組織不同部位BDNF表達(dá)情況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),大腦、小腦、腦干部位BDNF灰度值變化趨勢(shì)基本一致。本研究結(jié)果揭示BDNF在腦損傷后短期內(nèi)表達(dá)水平即有改變并且具有時(shí)序性規(guī)律,這種規(guī)律為將BDNF應(yīng)用到腦損傷時(shí)間推斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    本研究的BDNF表達(dá)高峰出現(xiàn)在傷后6 h,與賈叢林等[16]報(bào)道的在傷后2 h表達(dá)高峰,以及與董吉容等[15]報(bào)道的在輕度和中度損傷組分別在2、4 h表達(dá)高峰不一致,這種不一致可能是由于損傷機(jī)制和程度不同造成的。本研究建立的腦損傷病死率低,損傷不嚴(yán)重,因而引發(fā)的機(jī)體自我保護(hù)程度輕。這與董吉容等[15]報(bào)道的BDNF表達(dá)水平與損傷程度呈正相關(guān)一致。但是由于腦損傷方式不一,在不同損傷機(jī)制下腦損傷程度分級(jí)不一,所以本實(shí)驗(yàn)的損傷程度與董吉容等[15]的損傷程度分級(jí)無可比性,因而表現(xiàn)在具體的表達(dá)水平變化趨勢(shì)上并不完全一致。與GDNF相比,BDNF表達(dá)水平在回到正常對(duì)照組水平前,各時(shí)間點(diǎn)上都有顯著性差異(P < 0.05),因此本研究認(rèn)為BDNF作為腦損傷推斷時(shí)間的指標(biāo)將會(huì)有更大的優(yōu)勢(shì)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2014-03-04 本文編輯:任 念)

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