金水鮮聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞血管生成及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)關(guān)系的研究

張衛(wèi)平+++++戈偉++++++劉梁

[摘要] 目的 研究金水鮮聯(lián)合放療對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處理后的細(xì)胞存活力，以及抗血管生成蛋白表達(dá)與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系變化。 方法 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞按處理因素的不同分為4組，生理鹽水（NC）組、金水鮮（JSX）組、放射治療+金水鮮（RT+JSX）組、放射治療（RT）組，用CCK8試劑盒處理4 h后酶標(biāo)儀測(cè)OD450值，收集細(xì)胞裂解后測(cè)定蛋白濃度并蛋白凝膠（WB）電泳，分析血管促進(jìn)因子蛋白血管生成因子（VEGF）/胎盤(pán)源性生長(zhǎng)因子（PIGF）和突變型P53以及促凋亡蛋白FAS蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果 ①CCK8檢測(cè)各組經(jīng)過(guò)處理后細(xì)胞的增殖活力，RT+JSX組細(xì)胞的增殖活力最低，與JSX組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；JSX組與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。②Western-blot結(jié)果顯示在第48小時(shí)，JSX組VEGF蛋白的表達(dá)下降明顯；而在RT+JSX組中促凋亡蛋白FAS的表達(dá)明顯增加，突變型P53蛋白的表達(dá)下降，與JSX組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示聯(lián)合使用金水鮮增強(qiáng)了放療自身的促凋亡作用。 結(jié)論 金水鮮聯(lián)合放療可能發(fā)揮藥物單獨(dú)具有的血管生成抑制作用，并能增強(qiáng)單用放療的細(xì)胞促凋亡效果，考慮為金水鮮在影響血管生成方面能增加放療的敏感性，激活細(xì)胞凋亡相關(guān)因子FAS和下調(diào)突變型P53，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

[關(guān)鍵詞] 金水鮮；放射治療；抗血管生成；凋亡；相互作用

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）07（a）-0012-05

目前非小細(xì)胞肺癌的綜合治療模式中，放射治療已經(jīng)作為患者術(shù)后優(yōu)選的輔助治療措施[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在肺癌患者的治療過(guò)程中約70%的患者需要接受放療，但是腫瘤治療區(qū)內(nèi)正常組織對(duì)放射劑量的耐受，周邊正常肺組織，心臟大血管等重要組織器官所能承受的最大輻射劑量限制了目前放療靶區(qū)的劑量提高，因此眾多放療學(xué)者聚焦于放療增敏的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和聯(lián)合治療的探索[2]。本研究組前期報(bào)道的金水鮮對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)因子生成有明顯抑制作用，聯(lián)合處理肺癌細(xì)胞后顯著抑制其生長(zhǎng)能力，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中則觀察到明顯延緩腫瘤生長(zhǎng)。金水鮮作為國(guó)家自主研發(fā)的中藥，以名貴中藥材組方而成，采用超低溫分離，保證有效成分的分子結(jié)構(gòu)配比，承合傳統(tǒng)的中醫(yī)扶正蕩邪理論，應(yīng)用經(jīng)濟(jì)且低毒，目前在北京等臨床醫(yī)院治療領(lǐng)域顯示了廣闊的前景，已受到腫瘤界學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]。

本研究在前期細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[4-5]，發(fā)現(xiàn)金水鮮聯(lián)合放療抗腫瘤效果是否是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑還不明確，故本實(shí)驗(yàn)擬使用金水鮮凍干粉懸液聯(lián)合放療處理肺腺癌A549細(xì)胞，后觀察對(duì)血管生成主要相關(guān)蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PIGF）以及細(xì)胞凋亡通路的P53、FAS蛋白表達(dá)，探討血管生成對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，探討二者聯(lián)合是否會(huì)增強(qiáng)放射線本身具有的誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用，闡明抗血管生成藥物聯(lián)合放療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床放療的指導(dǎo)意義，為臨床采用聯(lián)合放療增敏方式的選擇和治療評(píng)價(jià)提供依據(jù)，期待讓它為癌癥聯(lián)合治療方面發(fā)揮更大的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與細(xì)胞放療設(shè)備 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤研究所惠贈(zèng)），放射治療設(shè)備采用武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤治療中心美國(guó)Varian公司23 EX直線加速器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及實(shí)驗(yàn)試劑 金水鮮凍干粉（北京建生藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)，批號(hào)：20130208），規(guī)格：5 mg/瓶，用前生理鹽水稀釋成為25 μg/mL濃度的藥物懸液進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)處理。主要實(shí)驗(yàn)試劑有CCK8試劑盒（碧云天，批號(hào)C0038），30%丙烯酰胺（Amresco，批號(hào)0712），PMSF（碧云天，批號(hào)ST506），RIPA裂解液（碧云天，批號(hào)P0013B），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，批號(hào)P0010），化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（世紀(jì)康為生物公司，批號(hào)T-37），GAPDH單抗（碧云天，批號(hào)AG019），P53單抗（碧云天，批號(hào)AP062-1），F(xiàn)AS單抗（SantaCruz，批號(hào)sc-1023），HRP-羊抗鼠IgG（碧云天，批號(hào)S1-033），PIGF單抗（Santa Cruz，批號(hào)sc-54306）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Themo，美國(guó)），凈化工作臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠，中國(guó)），恒溫培養(yǎng)箱（Themo，美國(guó)），Mini-Protean 4 垂直電泳儀及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-rad，美國(guó)），微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo scientific）、分光光度計(jì)（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司），超級(jí)純水儀（艾科浦），電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，HW-SY11-K P2），倒置相差顯微鏡（日本，Olympus IMT-2），紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549常規(guī)接種于含10%FBS、1%的青霉素-鏈霉素的改良型1640培養(yǎng)基中，并常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中，間隔2 d更換培養(yǎng)液1次，于80%左右的細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活度，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行藥物聯(lián)合放療干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分盤(pán)細(xì)胞隨機(jī)分為4組，生理鹽水（NC）組，金水鮮（JSX）組，放射治療+金水鮮（RT+JSX）組，放射治療（RT）組，細(xì)胞貼壁后24 h按照如下方法進(jìn)行處理：①NC組：向培養(yǎng)液中加入50 μL的生理鹽水。②JSX組：向培養(yǎng)液中加入金水鮮懸液50 μL。③RT+JSX組：給藥方法和放療劑量同單獨(dú)處理組，放療前半小時(shí)給予藥物處理。④RT組：使用電子線照射，腫瘤表面覆蓋2 cm的組織等效材料，源皮距SSD = 80 cm，放療劑量為2 Gy。

1.2.3 細(xì)胞處理后CCK8檢測(cè)增殖能力 于第1天分別消化不同處理組培養(yǎng)基，DMEM懸浮，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整為100 000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，后于96孔板中分別加入100 μL細(xì)胞懸液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)12 h，于第2天加藥以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，37℃下孵育培養(yǎng)48 h，中間換液PBS清洗2次，檢測(cè)前向各孔中加入10 μL CCK后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的OD值。根據(jù)所測(cè)得的吸光度用公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖活力，A549細(xì)胞細(xì)胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞處理后BCA法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況 蛋白樣品制備：藥物或放療處理細(xì)胞后于于第48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。收集細(xì)胞時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，PBS清洗2遍；加入0.25%胰酶培養(yǎng)箱中消化5 min，吹打細(xì)胞至單個(gè)細(xì)胞懸液，吸取懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1200 r/min，5 min，棄上清；加入適當(dāng)體積的冰上預(yù)冷的RIPA裂解液（用時(shí)加入PMSF，Coctail蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，中途顛倒混勻3次；4℃，1500 r/min，5 min；吸取上清至新預(yù)冷的離心管中，即為蛋白樣品。取出25 μL蛋白樣品待定量使用，剩余樣品加入5×SDS loading buffer，沸煮10 min，瞬時(shí)離心。采用天根生化科技有限公司BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，操作步驟主要有：①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。②根據(jù)細(xì)胞處理多少，50∶1的比例配制BCA工作液A和B，混勻待用。③分別吸取25 μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別加入到96孔板中。④加入200 μL BCA工作液，充分混勻，37℃恒溫孵育30 min。⑤取出步驟五的混合液在酶標(biāo)儀于570 nm處檢測(cè)吸光值。⑥根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度曲線計(jì)算出各處理組樣品蛋白濃度。用1×SDS loading buffer補(bǔ)齊至各組同一濃度，即可上樣電泳，用完的蛋白樣品保存于-40℃冰箱中。

1.2.5 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提取的蛋白Western-blot電泳 ①電泳模具組裝，同時(shí)制備8%分離膠和5%濃縮膠灌注，帶凝固后準(zhǔn)備上樣。②根據(jù)前面的蛋白濃度3 μg/μL，每孔上樣15 μL，上樣總量45 μg，電泳緩沖液中80 V電泳，至Marker到分離膠分開(kāi)后，加壓至120 V恒壓至溴酚藍(lán)跑完。③轉(zhuǎn)膜：根據(jù)分離膠的大小剪1塊PVDF膜（甲醇浸泡15 s至半透明），從負(fù)極到正極依次制作排列為海綿、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿的折疊形狀，玻璃棒趕走膠與膜之間的氣泡1700 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h。④封閉：5%脫脂奶粉中，于60轉(zhuǎn)搖床上室溫封閉1 h。⑤一抗孵育：5%BSA配制一抗（1∶3000～1∶10 000），4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。⑥回收稀釋的抗體。洗滌：TBST于150轉(zhuǎn)搖床上10 min/3次。⑦加入二抗孵育液（1∶4000，牛奶稀釋），室溫濕盒中孵育2 h。⑧洗滌：TBST于150轉(zhuǎn)搖床上10 min/3次。⑨觀察結(jié)果：1∶1配制顯影液和穩(wěn)定劑，取200 μL試劑均勻覆蓋于剪好的膜上，均勻孵育后生物發(fā)光影像分析儀掃描成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞采用CCK8檢測(cè)肺癌細(xì)胞增殖活力變化

細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同實(shí)驗(yàn)條件處理48 h后，檢測(cè)OD450吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖活力。結(jié)果顯示：RT+JSX組細(xì)胞的增殖活力明顯受到抑制，與JSX組的細(xì)胞增殖活力比較（兩組增殖活力分別為82.35%和47.68%），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；JSX組與NC組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 各組采用不同處理方法后對(duì)肺癌細(xì)胞蛋白濃度測(cè)定

采BCA蛋白定量各處理組蛋白濃度，計(jì)算加入5×lodding后總蛋白濃度為NC組（5.85±1.23）μg/μL，JSX組（4.05±0.92）μg/μL，RT+JSX組（2.75±0.21）μg/μL，RT組（3.31±0.09）μg/μL，根據(jù)鋪盤(pán)細(xì)胞同樣數(shù)量計(jì)算，聯(lián)合處理組在48 h后細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡或凋亡更多，其中聯(lián)合應(yīng)用RT+JSX治療對(duì)A549的細(xì)胞促進(jìn)死亡作用更為明顯，與JSX組蛋白濃度測(cè)定比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.5798，P = 0.0038），與RT組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 5.257，P = 0.0134）。而JSX組和RT組之間的細(xì)胞裂解后蛋白濃度進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。證明不同處理方法實(shí)施后，細(xì)胞發(fā)生了增殖或者凋亡的變化。而這種變化是否是通過(guò)凋亡途徑發(fā)生的，有待通過(guò)蛋白定量試驗(yàn)證實(shí)。

2.3各組細(xì)胞血管生成蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量研究

實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot 方法檢測(cè)A549細(xì)胞不同方法處理后血管生成蛋白VEGF和PIGF，凋亡相關(guān)蛋白P53、Fas的表達(dá)變化。結(jié)果如圖3所示：RT組的VEGF、PIGF等血管生成相關(guān)蛋白明顯增加，JSX組的VEGF蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。另外，細(xì)胞進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)處理對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響中，變化最明顯的FAS蛋白，RT+JSX組FAS蛋白的表達(dá)明顯高于RT組和JSX組。對(duì)于突變型P53蛋白的表達(dá)，RT+JSX組的P53表達(dá)降低，這說(shuō)明金水鮮聯(lián)合放療處理，可以降低這種突變型抑癌蛋白的表達(dá)。

3 討論

金水鮮作為天然基因類藥物，多靶點(diǎn)地針對(duì)DNA損傷修復(fù)、血管發(fā)生過(guò)程、腫瘤微環(huán)境以及機(jī)體的免疫功能發(fā)揮全面抑癌功能，其還可以阻滯腫瘤細(xì)胞S期分裂，恢復(fù)對(duì)癌細(xì)胞惡變的調(diào)控，另外抑制瘤體周圍新生血管的出芽，阻斷癌細(xì)胞繁殖的營(yíng)養(yǎng)氧氣，提高髓系細(xì)胞及白介素的含量，加強(qiáng)免疫監(jiān)視，通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)放化療的減毒增效，實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)自主的抗癌整合治療新模式。北京中日友好醫(yī)院等對(duì)大樣本肺癌中、晚期患者長(zhǎng)期的隨訪表明：“金水鮮”有廣泛的治療作用，患者PS評(píng)分顯著改善；腫瘤惡性癥狀減少或消失；放化療的不良反應(yīng)減輕。機(jī)體在免疫恢復(fù)造血和抗感染能力恢復(fù)時(shí)間縮短[3]。

放療作為局部治療手段，受照射后的腫瘤細(xì)胞乏氧比例急劇升高腫瘤，氧是放療最敏感的因素，乏氧導(dǎo)致放療耐受，同時(shí)乏氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的增加能促進(jìn)VEGF、EGFR、生存素等相關(guān)基因的表達(dá)，腫瘤血管新的發(fā)生對(duì)大于1 cm腫瘤生長(zhǎng)提供必要的物質(zhì)來(lái)源，而且一旦血管形成，必將獲得快速侵襲轉(zhuǎn)移的能力，導(dǎo)致疾病預(yù)后不良[6]。

本研究組前期試驗(yàn)，對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行不同處理后分組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，Real-Time PCR檢測(cè)各組HIF-1α及bFGF、VEGF信使RNA的表達(dá)情況。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了金水鮮聯(lián)合放療能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，而JSX組與NC組的差異不明顯，考慮金水鮮不是直接通過(guò)殺死腫瘤細(xì)胞而達(dá)到生長(zhǎng)抑制效果，而是通過(guò)金降低細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管生長(zhǎng)，作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制放療誘導(dǎo)的VEGF、bFGF等基因的表達(dá)，達(dá)到放療協(xié)同作用[4-5]。

在腫瘤血管生成過(guò)程中，VEGF是最重要促進(jìn)因子，其蛋白濃度影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移，以及新生微管侵潤(rùn)的方向，而其中主要的PIGF，直接和間接地幫助血管生成以及影響血管的通透性[7]。而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的因素復(fù)雜，腫瘤發(fā)生后，突變型P53是一種促癌基因，表達(dá)增加通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄達(dá)到腫瘤發(fā)展，不能抑制腫瘤的增殖周期，與預(yù)后轉(zhuǎn)移、化放療不敏感有關(guān)。Fas促凋亡因子的高表達(dá)，主要介導(dǎo)Fas/Fasl通路，抑制腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)[8-9]，故本研究檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生密切相關(guān)的P53、Fas蛋白表達(dá)水平，分析其與血管生成相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，為科學(xué)合理地運(yùn)用抗血管生成治療奠定理論基礎(chǔ)。

其中促血管生成最重要的VEGF家族，它是調(diào)控維持血管存活的關(guān)鍵起始點(diǎn)，包括各個(gè)VEGF亞型分子，分布與不同部位，不同介導(dǎo)血管生成部分機(jī)制相關(guān)，其中PIGF更是通過(guò)影響血管的通透性來(lái)調(diào)節(jié)血管新生的結(jié)構(gòu)功能，從而促進(jìn)腫瘤增大增長(zhǎng)，首先通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的增殖活力是否受到抑制，通過(guò)圖1可知RT+JSX組的活力明顯降低，可能存在更大的細(xì)胞凋亡發(fā)生，與JSX組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），也說(shuō)明金水鮮聯(lián)合應(yīng)用更容易發(fā)揮抗腫瘤療效。然后收集蛋白計(jì)算細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度，在收集細(xì)胞時(shí)去掉上清液以及上層懸浮死細(xì)胞，以驗(yàn)證存活細(xì)胞量是否與CCK8的檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)果顯示RT組和RT+JSX組之間細(xì)胞蛋白的濃度明顯低于NC組及JSX組，說(shuō)明細(xì)胞死亡更多，臨床治療意義更大。與本研究前期所驗(yàn)證的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和基因表達(dá)研究結(jié)果相一致。但是這種血管生成的抑制是否也通過(guò)增強(qiáng)了放療引起的細(xì)胞凋亡途徑，仍然是需要證明的一個(gè)問(wèn)題。然而細(xì)胞凋亡與增殖的不平衡是腫瘤形成的直接原因[10]，鑒于肺癌中的FAS及P53基因的功能多有異常，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步探討血管生成對(duì)抑制細(xì)胞凋亡的影響。因?yàn)樵谀[瘤變大變的富有浸潤(rùn)性之前，其分泌的VEGF增加，加速腫瘤演進(jìn)轉(zhuǎn)移過(guò)程，必然伴隨著細(xì)胞凋亡的減弱與抑制[11]。

在裂解后的蛋白Western-blot中結(jié)果可知JSX組的抗血管生成作用明顯強(qiáng)于放療和NC組，而放療后的HIF-1α可能刺激的VEGF表達(dá)誘使血管生成變慢，但是對(duì)凋亡蛋白FAS的檢測(cè)顯示，聯(lián)合處理組促進(jìn)了凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）特指細(xì)胞的主動(dòng)消亡，在機(jī)體發(fā)育，細(xì)胞表型控制以及生活的微環(huán)境中發(fā)揮重要信號(hào)作用。其啟動(dòng)和進(jìn)行受到獨(dú)特的系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)，首先是凋亡刺激因子傳至靶向細(xì)胞內(nèi)，激活靶分子而產(chǎn)生效應(yīng)，靶向胞內(nèi)途徑的線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和胞外途徑的死亡受體通路是最常見(jiàn)的的三種方式，之間又相互聯(lián)系相互協(xié)調(diào)共同維持細(xì)胞的代謝平衡。細(xì)胞收照射后，在單用放療組細(xì)胞中，本研究組觀察到凋亡形態(tài)變小，胞漿濃縮，細(xì)胞膜皺縮但并未破損，胞核固縮，染色質(zhì)濃染致密，呈向周邊富集，進(jìn)而胞膜內(nèi)陷，被包繞成獨(dú)立的數(shù)個(gè)凋亡小體，而在聯(lián)合處理組，這種現(xiàn)象更加明顯[9]。因此這種聯(lián)合放療的促凋亡發(fā)生可以通作為放射敏感性的預(yù)后因子供臨床使用，張美琴等[12]對(duì)宮頸癌放療前、后的細(xì)胞凋亡數(shù)與腫瘤控制關(guān)系的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，放射誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞數(shù)與腫瘤局部控制率呈正相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)VEGF和PIGF的表達(dá)與FAS蛋白的表達(dá)成正比，與突變型P53蛋白的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，這種蛋白表達(dá)的相互關(guān)系也證明了抑制血管生成可以促進(jìn)凋亡的發(fā)生，為抗血管生成治療聯(lián)合放療提供了一個(gè)新的腫瘤防治新思路[13]。

金水鮮通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的平衡，促進(jìn)傳統(tǒng)腫瘤治療的作用模式已經(jīng)得到腫瘤界廣泛關(guān)注，符合現(xiàn)代腫瘤生物治療新模式，本實(shí)驗(yàn)主要從突變型P53蛋白和促凋亡蛋白FAS的表達(dá)與抗血管生成相關(guān)蛋白VEGF家族的表達(dá)關(guān)系入手，進(jìn)行抗血管生成和促進(jìn)凋亡的初步研究，是否還存在其他的凋亡因子和具體信號(hào)機(jī)制參與，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，例如，凋亡的共同激活途徑之下，caspase表達(dá)的變化，隨著抗血管生成藥物的長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用是否會(huì)完全抑制血管生成，從而加重腫瘤的乏氧引起腫瘤放療抗拒和凋亡減弱，這些本研究組將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證。

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（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：蘇 暢）

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（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：蘇 暢）