三葉青提取物誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的研究

李萍　彭昕

[摘要] 目的 探討三葉青提取物對(duì)體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。 方法 四氮噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)三葉青提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制增殖作用及其時(shí)效、量效關(guān)系；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 隨著三葉青提取物濃度升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比較有明顯差異（P<0.05），Hela細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的凋亡特征性改變。 結(jié)論 三葉青提取物對(duì)人宮頸癌Hela 細(xì)胞具有明顯的體外細(xì)胞毒作用，其毒性作用與藥物的濃度和作用時(shí)間呈明顯正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 三葉青；Hela細(xì)胞；誘導(dǎo)凋亡；MTT法

[中圖分類號(hào)] R73-36； R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）23-0004-03

[Abstract] Objective To study the effect of extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of human cervical cancer Hela cells. Methods MTT assay was used to determine the inhibitory rate of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg on the proliferation of HeLa cells. The morphology of cell apoptosis was observed by inverted microscope. Results The inhibition ratio of tumor cell was gradually increased with the longer extension time or the increase of dosages of the extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et gilg the treatment groups was significant differentce（P<0.05） compared with the control group. Under inverted microscope， the tumor cells showed a special phenomenon of cellular apoptosis. Conclusion The extracts of tetrastigma hemsleyanum diels et gilg has a significant toxicological effect on human cervical cancer Hela cells， which positively relates with its concentration and effect time.

[Key words] Tetrastigma hemsleyanum diels et gilg； Hela cells； Apoptosis-inducing； MTT assay

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤， 發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位[1]。目前臨床治療使用的化療藥物多有較強(qiáng)的毒副作用和耐藥性問題，從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物新藥開發(fā)的熱門課題[2]。三葉青是我國(guó)浙江、江西、廣西等少部分地區(qū)獨(dú)有的珍稀中藥品種[3]，可用于治療肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，也是抗腫瘤常用藥物[4，5]。有研究發(fā)現(xiàn)三葉青總黃酮能顯著地抑制肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且細(xì)胞有明顯的凋亡特征性改變[6-9]。本研究主要探討三葉青提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用，為其臨床應(yīng)用于宮頸癌治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

MTT 購(gòu)于Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；HF/60W二氧化碳培養(yǎng)箱，由香港Hecnforce公司生產(chǎn)；OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀（型號(hào)XMARK）由美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn)。

1.2 三葉青提取物制備

三葉青藥材購(gòu)自寧波鄞州醫(yī)藥藥材公司，稱取三葉青藥材1000 g，采用堿性稀醇浸提，酸化沉淀法[9]得三葉青提取物6.9 g。

1.3細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞生化所，接種于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃飽和濕度，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)Hela細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁80%以上時(shí)，加入0.25%的胰蛋白酶消化，制成1×105/mL細(xì)胞懸液。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

實(shí)驗(yàn)分為加藥組和對(duì)照組（不含藥物，加等體積培養(yǎng)液），加藥組每孔加入不同濃度的三葉青提取物，終濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、16 mg/mL，每組5個(gè)復(fù)孔。

1.5 四氮噻唑藍(lán)（MTT）比色法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10，11]方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，加入各濃度的藥液100 μL。對(duì)照組加100 μL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h或48 h后，棄上清液，在各孔中加入向每孔加入MTT儲(chǔ)液50 μL（5 mg/mL），震蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h小心吸除各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩器上震蕩溶解10 min，空白調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)570 nm處各孔吸光度，按公式細(xì)胞增殖抑制率（IR）=（1-A 加藥組的平均值/A對(duì)照組的平均值）×100%計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率。

1.6光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，5個(gè)不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設(shè)不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對(duì)照組細(xì)胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并照相，比較加藥組和對(duì)照組Hela細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞OD值逐漸減少，表明其對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨著濃度的增大，處理時(shí)間的增加而加強(qiáng)。與對(duì)照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實(shí)驗(yàn)所采用的濃度范圍之內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用有明顯的劑量及時(shí)間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析結(jié)果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術(shù)和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對(duì)肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時(shí)毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導(dǎo)凋亡已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)，不少學(xué)者以體外細(xì)胞株為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細(xì)胞周期、改變細(xì)胞凋亡基因及蛋白的表達(dá)或相關(guān)酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關(guān)注。有報(bào)道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，其細(xì)胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導(dǎo)凋亡，具有濃度依賴性。馮正權(quán)等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，檢測(cè)三葉青黃酮對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性，且細(xì)胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，激活機(jī)體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預(yù)后的抑瘤率達(dá) 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測(cè)）的方法，對(duì)5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細(xì)胞凋亡特征性改變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細(xì)胞增殖作用，且呈濃度/時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)。關(guān)于增殖抑制率的評(píng)價(jià)一般認(rèn)為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)越敏感。通過光學(xué)顯微鏡觀察Hela細(xì)胞形態(tài)，可見細(xì)胞變圓、細(xì)胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結(jié)果顯示三葉青提取物對(duì)Hela細(xì)胞具有很好的腫瘤細(xì)胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細(xì)胞凋亡的指標(biāo)[18]，本課題組擬進(jìn)一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法定性分析凋亡細(xì)胞的DNA裂解，通過流式細(xì)胞儀定量分析三葉青作用后的細(xì)胞凋亡率及其細(xì)胞周期改變，并檢測(cè)三葉青提取物作用后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的改變以明確其促凋亡的分子機(jī)制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進(jìn)一步提供可靠的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張麗云. 柴胡、苦參、大黃、黃柏對(duì)人宮頸癌細(xì)胞抑制效果的研究[D]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

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[8] 汪珍，馮健，王曉華. 三葉青提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞凋亡的影響[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008， 32（3）：321-323.

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（收稿日期：2014-02-27）

1.6光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，5個(gè)不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設(shè)不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對(duì)照組細(xì)胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并照相，比較加藥組和對(duì)照組Hela細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞OD值逐漸減少，表明其對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨著濃度的增大，處理時(shí)間的增加而加強(qiáng)。與對(duì)照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實(shí)驗(yàn)所采用的濃度范圍之內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用有明顯的劑量及時(shí)間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析結(jié)果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術(shù)和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對(duì)肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時(shí)毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導(dǎo)凋亡已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)，不少學(xué)者以體外細(xì)胞株為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細(xì)胞周期、改變細(xì)胞凋亡基因及蛋白的表達(dá)或相關(guān)酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關(guān)注。有報(bào)道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，其細(xì)胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導(dǎo)凋亡，具有濃度依賴性。馮正權(quán)等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，檢測(cè)三葉青黃酮對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性，且細(xì)胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，激活機(jī)體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預(yù)后的抑瘤率達(dá) 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測(cè)）的方法，對(duì)5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細(xì)胞凋亡特征性改變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細(xì)胞增殖作用，且呈濃度/時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)。關(guān)于增殖抑制率的評(píng)價(jià)一般認(rèn)為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)越敏感。通過光學(xué)顯微鏡觀察Hela細(xì)胞形態(tài)，可見細(xì)胞變圓、細(xì)胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結(jié)果顯示三葉青提取物對(duì)Hela細(xì)胞具有很好的腫瘤細(xì)胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細(xì)胞凋亡的指標(biāo)[18]，本課題組擬進(jìn)一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法定性分析凋亡細(xì)胞的DNA裂解，通過流式細(xì)胞儀定量分析三葉青作用后的細(xì)胞凋亡率及其細(xì)胞周期改變，并檢測(cè)三葉青提取物作用后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的改變以明確其促凋亡的分子機(jī)制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進(jìn)一步提供可靠的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-02-27）

1.6光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，5個(gè)不同濃度藥物（同MTT）分別處理，并設(shè)不加藥物只加等量培養(yǎng)液的為對(duì)照組細(xì)胞，分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并照相，比較加藥組和對(duì)照組Hela細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析

由表1可見隨著三葉青提取物濃度的增大，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞OD值逐漸減少，表明其對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨著濃度的增大，處理時(shí)間的增加而加強(qiáng)。與對(duì)照組比較，除了1mg/mL藥物處理24 h組外，其他各藥物處理組的OD值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。表明三葉青提取物濃度本實(shí)驗(yàn)所采用的濃度范圍之內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用有明顯的劑量及時(shí)間依賴。經(jīng)不同濃度三葉青提取物作用后的各組Hela細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果及方差分析結(jié)果如表2、3所示。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有20多萬女性死于宮頸癌。目前臨床多采用以手術(shù)和放療為主、化療為輔的治療方案，但常規(guī)放化療對(duì)肝、腎等器官的毒副作用大，且易產(chǎn)生多藥耐藥性，治療效果不盡如人意[13]。尋找療效好同時(shí)毒副作用較小的天然藥物有重要的臨床意義。近年來中藥誘導(dǎo)凋亡已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)，不少學(xué)者以體外細(xì)胞株為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響細(xì)胞周期、改變細(xì)胞凋亡基因及蛋白的表達(dá)或相關(guān)酶的活性等途徑來有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。三葉青為浙江省地方性傳統(tǒng)中藥，最近因其被發(fā)現(xiàn)具有抗多種腫瘤的生物活性而被廣泛關(guān)注。有報(bào)道顯示[15]，三葉青提取物與肺癌 A549細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，其細(xì)胞活性顯著性降低，且DNA 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)“梯狀”條帶，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志。汪珍等[8]觀察三葉青提取物對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示：三葉青提取物能顯著地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能下調(diào) Bcl-XL、上調(diào)Bid來誘導(dǎo)凋亡，具有濃度依賴性。馮正權(quán)等[16]通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，檢測(cè)三葉青黃酮對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明：三葉青黃酮能顯著抑制 SGC-7901細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性，且細(xì)胞周期分析顯示有明顯的凋亡峰出現(xiàn)，并能降低細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的含量。此外，三葉青提取物能夠改善荷瘤小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，激活機(jī)體的抗氧化作用途徑，具有一定的體內(nèi)抑瘤效果，其高劑量干預(yù)后的抑瘤率達(dá) 36.06%[17]。

本研究通過定量（MTT）和定性（顯微鏡觀測(cè)）的方法，對(duì)5種不同濃度的三葉青的提取物作用后的Hela細(xì)胞凋亡特征性改變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所采用濃度范圍內(nèi)三葉青提取物均有抑制Hela細(xì)胞增殖作用，且呈濃度/時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)。關(guān)于增殖抑制率的評(píng)價(jià)一般認(rèn)為[1]，<30%為不敏感（耐藥），>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，由本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可知，8 mg/mL的三葉青提取物作用24 h后對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)即有中度敏感的抑制作用（36.85%），且隨其濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)越敏感。通過光學(xué)顯微鏡觀察Hela細(xì)胞形態(tài)，可見細(xì)胞變圓、細(xì)胞核固縮、核碎裂及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)，隨著濃度的增加該特征越明顯。因此，本研究結(jié)果顯示三葉青提取物對(duì)Hela細(xì)胞具有很好的腫瘤細(xì)胞毒作用，是很有潛力的抗宮頸癌藥物。但本研究中的方法僅為初步觀察細(xì)胞凋亡的指標(biāo)[18]，本課題組擬進(jìn)一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法定性分析凋亡細(xì)胞的DNA裂解，通過流式細(xì)胞儀定量分析三葉青作用后的細(xì)胞凋亡率及其細(xì)胞周期改變，并檢測(cè)三葉青提取物作用后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的改變以明確其促凋亡的分子機(jī)制，為開發(fā)研制宮頸癌治療的新候選藥物進(jìn)一步提供可靠的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-02-27）