大孔吸附樹脂純化二冬膏總皂苷工藝研究

★ 張理波 季巧遇 眭榮春 李露爽 張娟娟

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司 江西 南昌 330096)

二冬膏收載于《中國藥典》(2010年版)一部，由天冬、麥冬組成，具有養(yǎng)陰潤肺的功效，用于肺陰不足引起的燥咳痰少、痰中帶血、鼻干咽痛[1]。皂苷是麥冬、天冬中的主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究證明皂苷類在抗菌、抗血栓、祛痰止咳、止血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及對心血管系統(tǒng)等方面有顯著作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂法對二冬膏中總皂苷進(jìn)行純化，并對其純化工藝進(jìn)行了考察，為二冬膏的二次開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 貴州天冬，浙江麥冬(均購自安徽省亳州市中信中藥飲片廠，經(jīng)檢測符合《中華人民共和國藥典》2010年版一部有關(guān)各項(xiàng)規(guī)定)。菝葜皂苷元(含測用，中國藥品生物制品檢定所，批號(110744-200407)；D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、NKA-Ⅱ型、CAD-40型大孔樹脂、HPD600型大孔樹脂(均購于南開大學(xué)化工廠)；所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 儀器 UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本SHIMADZU)；AB204-N分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；

2 方法與結(jié)果

2.1 二冬膏總皂苷的提取和含量測定

2.1.1 二冬膏提取 按二冬膏處方(天冬500g麥冬500g)稱取藥材，加水提取3次，每次2h，加水量分別為12倍量、10倍量、10倍量，合并提取液，過100目篩，放冷。離心20min(4000r/min)，取上清液，減壓濃縮，制成濃度為0.066g生藥/mL的離心液，備用。

2.1.2 供試品溶液制備 精密吸取上述二冬膏提取液3mL，加水17mL稀釋，以水飽和正丁醇萃取5次(每次15mL)，正丁醇液水浴揮干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0mL，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取菝葜皂苷元對照品19.01mg，置于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 二冬膏總皂苷的含量測定[3]采用紫外分光光度法。精密吸取不同濃度菝葜皂苷對照品溶液及上述供試品溶液0.1mL，置具塞刻度試管中，70℃水浴蒸干，精密加入10mL高氯酸，65℃水浴加熱顯色15min取出，冰水冷卻15min，搖勻，以高氯酸空白溶液做參比，于紫外分光光度計(jì)上200～700nm進(jìn)行掃描，菝葜皂苷在312nm處有最大吸收，二冬膏總皂苷在310nm處有最大吸收，故選310nm為二冬膏總皂苷的測定波長。以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，得線性方程為：Y=1.4262X-0.0442(r=0.9998),表明菝葜皂苷元在0.09505mg～0.7604mg范圍內(nèi)與吸收值呈良好線性。

2.2 大孔樹脂的預(yù)處理 取D-101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600五種大孔樹脂裝于燒杯中，95%乙醇浸泡24h，，以95%乙醇動態(tài)清洗至醇洗脫液加數(shù)倍水后不顯渾濁，且洗脫液在200-400nm掃描無吸收峰為止，再用水洗至無醇味。

2.2 大孔樹脂型號的選擇 稱取已處理好的D101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600五種大孔吸附樹脂(相當(dāng)于干樹脂5g),置250mL具塞錐形瓶中，精密加入二冬膏提取液30mL(0.033g生藥/mL)，20℃恒溫振搖24h，分別取吸附前后的藥液，按上述測定方法測定總皂苷含量，計(jì)算得不同型號樹脂的比吸附量。吸附后的樹脂用水洗至Mollish反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，再加入95%乙醇50mL，20℃恒溫振搖4h，取解吸附前后藥液，測定醇洗脫液中二冬膏總皂苷含量，計(jì)算不同型號樹脂的洗脫率。結(jié)果見表1,可見，D101大孔吸附樹脂較好，故選擇D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化。

表1 不同型號大孔樹脂篩選結(jié)果(n=3)

2.3 大孔吸附樹脂洗脫溶劑的選擇 稱取已處理好的D-101大孔吸附樹脂4等份(相當(dāng)于干樹脂6.6g)，濕法裝柱，取二冬膏提取液4份，每份30mL(0.033g生藥/mL)，以2mL/min速度上樣。用蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，分別用50%、60%、70%、80%的乙醇洗脫，收集洗脫液，每5mL一份，精密吸取0.1mL，水浴蒸干，精密加入10mL高氯酸，按2.1.3含量測定方法測定其總皂苷含量。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，總皂苷含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，見圖2，由圖可知，80%乙醇洗脫效果較好。

圖1 不同濃度乙醇洗脫效果

2.4 最大上樣量考察 稱取已處理好的D-101大孔吸附樹脂(相當(dāng)于干樹脂23g)，濕法裝柱。取二冬膏提取液(0.033g生藥材/mL)上樣，上樣流速2mL/min，分段收集未吸附液，每份5mL，加水15mL稀釋，以水飽和正丁醇萃取5次(每次15mL)，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0mL，精密吸取0.1mL測定其總皂苷含量，以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中總皂苷的泄露百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線，如圖2。由圖2可知，當(dāng)上樣量為100mL時(shí)，流出液總皂苷的濃度超過了泄液點(diǎn)(原始濃度的10%)，故最大上樣量選擇95mL，即每克樹脂可吸附0.13g生藥。泄漏百分?jǐn)?shù)%=流出液中總皂苷含量/上柱液中總皂苷含量×100%。

圖2 二冬膏總皂苷泄漏曲線圖

3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取已處理好的D-101大孔吸附樹脂(相當(dāng)于干樹脂23g)，濕法裝柱(柱高比為1∶12)。量取二冬膏樣品溶液(濃度為0.066g生藥材/mL)47.5mL，以2mL/min的速度上柱，用7BV水洗至Mollish反應(yīng)呈陰性后，以80%乙醇洗脫，收集約3倍柱體積洗脫液，測定上柱前后洗脫液中的總皂苷含量和總固形物量；重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果見表2，可見經(jīng)大孔樹脂純化后，總皂苷純度由26.59%上升為62.07%，總皂苷平均收率為73.09%，表明D-101型大孔樹脂可用于二冬膏總皂苷的富集和純化。

表2 D-101大孔樹脂純化對二冬膏提取物純度的影響(n=3)

4 小結(jié)

4.1 大孔樹脂吸附技術(shù)被廣泛用于中藥有效成分的分離純化[4,5]。本文通過靜態(tài)吸附試驗(yàn)考察了D-101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600幾種不同型號大孔樹脂對二冬膏中總皂苷的吸附、解吸附能力，結(jié)果D101大孔樹脂純化效果最好。

4.2 大孔樹脂純化效果的其它影響因素，如柱高比、上樣流速、上樣濃度、洗脫用量等，未在文章中一一闡述；文中所用參數(shù)均通過實(shí)驗(yàn)研究所得。

4.3 以D-101型大孔吸附樹脂上柱前后的總固形物和總皂苷為指標(biāo)，大孔樹脂法可以有效去除雜質(zhì)，使二冬膏總皂苷的純度由26.59%上升為62.07%，平均收率為73.09%，結(jié)果穩(wěn)定，基本達(dá)到了純化效果。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：410.

[2]戴忠，姜紅.甾體皂苷研究進(jìn)展[J].中國藥師,2003,10(9):615-616.

[3]王松,許臘英,陳棟，等．天麥顆粒中總皂苷的含量測定[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(1)：40-42.

[4]蔡雄，劉中秋，王培訓(xùn)，等.大孔吸附樹脂富集純化人參總皂苷工藝[J].中成藥,2001,23(9)：631-633.

[5]周躍華，吳笑如，徐德生，等.大孔吸附樹脂純化麥冬總皂苷的工藝研究[J].中草藥,2003,34(12)：1 089-1 091.