正交試驗優(yōu)選減味壽胎丸總黃酮提取工藝

★ 劉秀明 羅頌平 馮婷 方家 陳靜靜

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510405)

壽胎丸源自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷和阿膠4味中藥組成，為婦科安胎常用名方，臨床上具有補脾益腎，養(yǎng)血固攝，安胎之功，能有效防治先兆流產(chǎn)。在臨床上，較多學(xué)者選用壽胎丸加減或壽胎丸聯(lián)合西藥治療胎漏、胎動不安及滑胎，從目前的報道來看，有效率均在90%左右，療效確切[1-3]。課題組前期證實去阿膠的減味壽胎丸具有與壽胎丸基本相同的安胎效果，明確了該方最佳藥效組合及配伍劑量，亦對減味壽胎丸進行了拆方研究，初步確定減味壽胎丸的黃酮類物質(zhì)藥效較為顯著[4-10]。為了使減味壽胎丸的黃酮進一步合理開發(fā)和利用，本研究采用單因素結(jié)合正交試驗設(shè)計法優(yōu)選出減味壽胎丸中總黃酮的最佳提取工藝,為減味壽胎丸藥效物質(zhì)的提取提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀系統(tǒng)(BUCHI)；實驗室專用超純水機(德國sartorius公司)；恒溫水浴鍋(上海一恒)；萬分之一電子天平(德國sartorius公司)；十分之一電子天平(雙杰牌)；紫外分光光度計(尤尼科(上海)儀器有限公司)。

1.2 試藥 蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，批號：10080-200707)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純試劑(天津大茂化學(xué)廠有限公司)；水為純水；菟絲子(批號：121002111，產(chǎn)地：山東)和續(xù)斷(批號：110108341，產(chǎn)地：山東)均購自康美公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波教授鑒定。桑寄生采摘自華南植物園，由華南植物園葉華古研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品約10mg，精密稱定至10mL容量瓶，用60%乙醇超聲溶解，放冷定容，得蘆丁對照品溶液濃度為0.112mg/mL。

2.1.2 標(biāo)準曲線的制備 精密吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL蘆丁標(biāo)準溶液，放入10毫升容量瓶內(nèi)，分別加入5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL的60%乙醇溶液；加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，放置6min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0mL，加60%乙醇定容，搖勻后，放置15min；在510nm處測定吸光度。用0mL作為空白，用濃度(X)作為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準曲線。得到回歸方程為：Y=1.205X，r=0.9998，線性范圍為0.112～0.56mg/mL。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度的考察 準確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號篩，分別加入10倍量的30%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇，回流提取1次，提取時間1.0h，濾過，用少量相應(yīng)溶劑洗滌藥渣和容器，濾液與洗滌液定容至250mL容量瓶中，精密移取1mL至10mL的容量瓶中，用相應(yīng)的溶劑稀釋至刻度，精密移取1mL樣品稀釋液，按標(biāo)準曲線制作項下“加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL搖勻”起，同法操作，顯色后于510nm波長處測定吸光度，計算總黃酮浸出量。結(jié)果顯示，乙醇濃度在30%～60%內(nèi)，隨著醇濃度升高，總黃酮浸出量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度超過60%后，隨濃度增加而遞減?？梢?，當(dāng)乙醇濃度達到60%時，總黃酮浸出量達到最大值。

表1 乙醇濃度考察

2.2.2 提取時間的考察 準確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號篩，加入10倍量的60%乙醇，回流提取1次，提取時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，濾過，用少量60%乙醇洗滌藥渣和容器，濾液與洗滌液定容至250mL量瓶中，其余步驟同“2.2.1”。結(jié)果見表2，結(jié)果顯示當(dāng)提取時間為1h時，總黃酮浸出量達到最大值。

表2 提取時間考察

2.2.3 料液比及提取次數(shù)的考察 準確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號篩，分別加入6，8，10，12，14，16倍的60%乙醇，每份分別回流提取3次，每次1h，每次所得提取液分別濾過，定容，其余步驟同“2.2.1”。分別計算每次提取液總黃酮浸出量。

從表3可以看出，當(dāng)料液比為1∶8時，累積總黃酮浸出量達到最大值。從表3中也可以計算出，第1、2次總黃酮浸出量已達累積總黃酮浸出量的95%以上，說明經(jīng)過2次回流提取后，黃酮類物質(zhì)已經(jīng)提取充分，因此提取次數(shù)定為2次。

表3 料液比和提取次數(shù)的考察

2.3 正交試驗 根據(jù)單因素考察結(jié)果及工業(yè)化生產(chǎn)實際，選擇乙醇濃度、料液比和提取時間為考察因素，分別設(shè)定3個水平，根據(jù)因素水平表(見表4)，選擇正交表(見表5)進行試驗，以減味壽胎丸總黃酮浸出量為指標(biāo)，可見分光光度法測定含量，利用minitab軟件對正交試驗的結(jié)果進行分析，結(jié)果見圖1、表7。

根據(jù)圖1主效應(yīng)圖和表6 minitab統(tǒng)計結(jié)果顯示乙醇濃度及料液比對產(chǎn)出的影響先是正效應(yīng)，后是負效應(yīng)，當(dāng)乙醇濃度在50%～60%間，隨乙醇濃度增加而總黃酮浸出量增加，同理料液比亦然，系數(shù)列中絕對值：47.78>39.17>3.61，則(50%～60%，1∶08～1∶10區(qū)間)影響大小：A>B>C。在60%～70%間，隨乙醇濃度增加而遞減，同理料液比例亦然，系數(shù)列中絕對值：39.17>28.06>5.56，則(60%～70%,1∶10～1∶12區(qū)間)影響大小：B>A>C。表7方差分析結(jié)果顯示，A(乙醇濃度)和B(提取時間)對減味壽胎丸總黃酮提取的影響有顯著意義，是影響減味壽胎丸總黃酮回流提取工藝的主要因素，在工藝中應(yīng)重點考慮，綜合以上分析，減味壽胎丸最佳提取工藝：乙醇濃度為60%，料液比為1∶10，回流提取2次，每次提取時間為0.5h。

表4 因素水平表

表5 正交設(shè)計表

圖1 主效應(yīng)圖

表6 minitab統(tǒng)計結(jié)果

表7 方差分析

2.4 最佳工藝驗證試驗 為進一步考察工藝的穩(wěn)定性，按最佳提取工藝，平行重復(fù)3次試驗：準確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號篩，加10倍體積60%乙醇，回流提取2次，每次0.5h，過濾定容至250mL，其余步驟同“2.2.1”。結(jié)果見表8，試驗結(jié)果可以看出提取工藝具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，適合減味壽胎丸總黃酮的提取。

表8 驗證試驗結(jié)果

3 討論

減味壽胎丸的主要藥效成分是黃酮類成分，成分較為復(fù)雜，黃酮苷一般能溶于水、稀乙醇、甲醇和乙酸乙酯等極性溶劑中。而黃酮苷元一般溶于乙醇、甲醇和乙酸乙酯、乙醚等溶劑中,不溶于水。故本試驗選擇乙醇水溶液作為提取溶劑。單因素考察和正交試驗結(jié)果可見，在低濃度和高濃度乙醇提取時，總黃酮浸出量都較低，可能與減味壽胎丸黃酮類物質(zhì)包含黃酮苷和黃酮苷元有關(guān)。

通過單因素考察及正交試驗優(yōu)化了減味壽胎丸總黃酮的提取工藝。最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度為60%，料液比為1∶10，回流提取2次，每次提取時間為0.5h。經(jīng)驗證重復(fù)性好，工藝簡單，省時節(jié)能，為進一步研究減味壽胎丸提供參考。

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