射頻消融治療大鼠肝泡狀棘球蚴病及病理改變

桑澤杰，朱帝文，紀(jì)衛(wèi)政，任偉新，顧俊鵬，張海瀟，溫 浩

射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）是 20世紀(jì)90年代初發(fā)展的微創(chuàng)治療肝腫瘤的方法，通過熱能使腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死。肝癌的RFA治療效果與腫瘤大小相關(guān)，對于直徑≤3 cm的小肝癌，其治療效果可與外科手術(shù)媲美[1]，近年來認(rèn)為≤7 cm的病灶都可以經(jīng)RFA完全消融。RFA具有適應(yīng)證廣泛、機體創(chuàng)傷小、手術(shù)安全性高的特點，有效性和適應(yīng)證較寬、不良反應(yīng)及并發(fā)癥少，能最大限度地保護(hù)剩余肝功能，已廣泛應(yīng)用于肝癌的局部治療[2]。肝泡狀棘球蚴?。╤epatic alveolar echinococcosis，HAE）是一種人獸共患寄生蟲病，由多房棘球蚴絳蟲感染所致，多為肝臟原發(fā)病灶，主要分布在我國西北部和西南部地區(qū)。該病發(fā)病率低，為0.3%～4.8%，某些牧區(qū)高達(dá)10%，是一種常見的地方病，新疆為該病高發(fā)區(qū)之一[3]。其生長方式類似腫瘤，呈浸潤性生長，侵犯周圍組織，同時可向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故又稱“蟲癌”[4]。確診該病時大部分患者已失去根治性切除機會，手術(shù)切除率僅為20%～40%[5]。目前該病多為手術(shù)切除聯(lián)合阿苯達(dá)唑治療，研究表明在患者生存概率和并發(fā)癥發(fā)生率方面姑息性手術(shù)聯(lián)合藥物組與單純藥物組無差異，且姑息性手術(shù)聯(lián)合藥物治療患者的病情更容易惡化，甚至死亡[6]。本實驗在直視下行RFA治療HAE，探討RFA治療HAE的安全性和有效性，通過天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）評估肝功能受損程度，探討RFA對殘余病灶組織泡球蚴存活的影響，對早期微小和難治性HAE治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇2月齡清潔級雄性Wistar大鼠 50只，體重（0.20±0.05）kg（新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心供給），大鼠飼養(yǎng)在清潔環(huán)境中。參照文獻(xiàn)制作大鼠HAE的疾病模型[7]。并于接種6個月后用B超篩查HAE種植情況[8]，選擇無鈣化型HAE模型動物。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 取30只病灶直徑（0.75±0.25）cm的HAE模型大鼠，分成對照組（假手術(shù)組）10只和實驗組20只。對照組開腹暴露HAE病灶后縫合；實驗組大鼠麻醉后，背部脫毛、分離和暴露HAE病灶，直視下將射頻電極插入肝臟病灶中心，調(diào)節(jié)功率為50 W，時間2 min。兩組動物分別于術(shù)前及術(shù)后3、5、7 d剪尾取血，檢測AST和ALT水平。第7天處死全部大鼠，取HAE組織標(biāo)本，部分置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片（每份標(biāo)本5片）、脫蠟、染色后行病理檢測，與肝功能測定結(jié)果一并進(jìn)行綜合分析。

1.2.2 HAE分級 根據(jù)泡球蚴的角質(zhì)層、生發(fā)層在光鏡下的病理形態(tài)學(xué)改變和育囊發(fā)育情況分為3級[9]。 0級（基本正常）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)基本正常，多數(shù)見育囊或芽生結(jié)構(gòu)，育囊內(nèi)有數(shù)量不等的原頭節(jié)，鈣顆粒形態(tài)正常。Ⅰ級（變性改變）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)存在，角質(zhì)層和生發(fā)層可辨認(rèn)，組織普遍變性腫脹，很少見育囊和原頭節(jié)。Ⅱ級（壞死）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)失常，生發(fā)層細(xì)胞核固縮、溶解或消失，育囊與原頭節(jié)少見；偶見鈣顆粒，形態(tài)模糊；重者有纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RFA對肝功能的影響

實驗組AST和ALT在術(shù)后第3天達(dá)最高值，分別為（193.89±9.31）u/L 和（60.07±2.68）u/L，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第5天AST和ALT值逐漸下降，分別為（169.04±7.76）u/L和（41.31±2.18）u/L，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第7天兩者均恢復(fù)至正常水平，分別為（106.73±5.15）u/L 和（31.57±3.44）u/L，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 HAE模型大鼠的病理改變

實驗組大鼠在實驗過程中意外死亡1只。RFA術(shù)后7 d，實驗組病理變化以Ⅱ級為主（17/19），光鏡下角質(zhì)層、生發(fā)層模糊，部分生發(fā)層細(xì)胞空泡變、核溶解；Ⅰ級2只，光鏡下可見泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)失常，角質(zhì)層、生發(fā)層普遍變性、分離或斷裂、脫落，皮層變薄，部分結(jié)構(gòu)被破壞（圖1）。

圖1 實驗組病理變化以Ⅱ級（壞死）為主（HE，×200）

2.3 組織病理學(xué)改變

肝HAE模型病灶呈浸潤性生長，無包膜，泡球蚴病灶細(xì)胞呈巢片狀或假腺樣分布，排列較為緊密，局部紊亂，細(xì)胞體積大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)嗜雙色性，核大小不一，深染，核染色質(zhì)粗，核仁明顯。消融治療后，射頻毀損區(qū)呈類球形。標(biāo)本毀損區(qū)中央呈灰白色，周邊水腫出血呈暗紅色，與周圍正常組織分界不清（圖2）。

圖2 RFA后中心區(qū)為大片不定形壞死組織；周邊見炎性反應(yīng)帶，其內(nèi)較多中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及紅細(xì)胞聚集；外圍為殘存的泡球蚴病灶及其邊緣帶組織（HE，×200）

3 討論

RFA機制是射頻電磁波震動引起離子相互摩擦產(chǎn)生熱量；電極針局部組織傳至病灶周圍溫度可達(dá)45～50℃，引起組織脫水及蛋白質(zhì)變性；局部溫度超過70℃時，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固性壞死[10-11]。但是，局部溫度超過100℃時，電極針周圍病灶組織出現(xiàn)炭化與氣化，此現(xiàn)象阻礙了熱量傳導(dǎo)。Valley公司的冷循環(huán)電極通過熱傳導(dǎo)系統(tǒng)帶走熱量，保持射頻電極局部病灶周圍的相對低溫，減少或避免消融病灶局部組織的氣化和炭化，同時可保證或擴大消融灶的范圍[10，12-13]。 同時，病灶周邊的微血管及組織凝固，使之不能繼續(xù)向病灶供血，不僅促進(jìn)殘存病灶死亡還有利于防止病灶轉(zhuǎn)移[14]。一直以來，手術(shù)切除是HAE僅有的治療方法[15]。而對早期的小病灶HAE，手術(shù)治療尚有爭議，主要以姑息性藥物阿苯達(dá)唑治療，但由于該藥溶解性較低，且在體內(nèi)廣泛分布，極大地減低了其生物利用度。近年以RFA為代表的局部治療為肝臟等實性占位病變治療提供了新的選擇。而RFA的出現(xiàn)大大提高了局部治療的療效，有文獻(xiàn)報道RFA治療肝囊性包蟲病的離體動物實驗顯示，RFA 具有良好的效果[16]。 Thanos 等[17]報道術(shù)后聯(lián)合RFA治療1例復(fù)雜肝包蟲囊腫取得滿意療效。

RFA治療HAE僅有個案報道，尚無大量有對照的研究。本實驗RFA后HAE病灶完全壞死率與文獻(xiàn)報道相似[18-19]，RFA灶周邊為炎性反應(yīng)，細(xì)胞間通透性增大，可見大量紅細(xì)胞滲出，炎性細(xì)胞聚集。術(shù)后肝功能檢測表明，RFA治療HAE安全，療效肯定，有強大的促進(jìn)組織壞死作用。RFA治療HAE有一定優(yōu)勢，實驗中部分HAE消融模型建立在HAE移植瘤基礎(chǔ)上，對動物肝臟損傷很小，相應(yīng)的動物耐受力則很強。我們在大鼠肝臟上同時觀察RFA后殘余病灶和RFA治療后局部致熱性損傷引起的良性炎癥反應(yīng)，模擬人原發(fā)性HAE的RFA后殘余病灶，提供了仿真的臨床研究模型，比較適用于原發(fā)性HAE的RFA后的病理學(xué)研究及療效判定等相關(guān)研究。

本實驗定制的灌注型RFA電極借助微量水泵將冷生理鹽水泵入消融病灶組織內(nèi)部，通過此方式既降低病灶組織周圍區(qū)域溫度，減少或避免炭化和氣化的發(fā)生，又增加消融病灶組織內(nèi)的離子數(shù)目，增強了離子震動及熱傳導(dǎo)，在不增加功率的情況下擴大病灶消融范圍[10，12-13]。

RFA治療因創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、療效確切等優(yōu)點，已成為最有前景的熱凝固消融方式。RFA治療HAE的目的在于原位滅活泡狀棘球蚴，最小限度地?fù)p傷正常肝組織；假手術(shù)組AST和ALT水平無明顯變化，而實驗組行RFA后第3天AST和ALT水平明顯升高，第5天仍較正常稍高，可能為RFA引起病灶局部微血管及組織凝固，局部有效血流絕對灌注較少，導(dǎo)致病灶局部細(xì)胞缺血缺氧，高能磷酸化合物如ATP減少，Na＋-K＋-ATP泵的酶活性下降，Ca2＋跨膜內(nèi)流增加，引起ATP分解活躍，為自由基的生成提供底物。同時，內(nèi)流的Ca2＋還可激活蛋白酶，催化次氧嘌呤的氧化反應(yīng)，最終生物膜脂質(zhì)氧化損傷。但在第7天，實驗組AST和ALT趨于正常，表明RFA雖對大鼠肝功能有一定的損傷，但仍可恢復(fù)。

實驗組大鼠病灶經(jīng)RFA后損傷主要以壞死為主（Ⅱ級），但仍有少數(shù)Ⅰ級病變，可能與泡球蚴病灶約0.8 cm有關(guān)，血供主要來自于門靜脈[20-22]，RFA治療時由門靜脈帶走較多熱量，消融不完全。此外，特殊部位如膈頂、心臟、靠近腸道等部位，也是消融不完全的原因[23-25]。本研究結(jié)果提示，開腹直視下RFA在治療大鼠HAE方面有較大的應(yīng)用潛力，短期內(nèi)病灶液化壞死明顯，HAE完全滅活，我們認(rèn)為RFA在治療HAE中可能有重要作用，對于治療微小及難治性HAE，可能是一種選擇，可望為臨床治療HAE提供新的治療方法。

本實驗通過制作大鼠HAE RFA治療模型，初步觀察RFA后短期內(nèi)病灶的病理學(xué)改變及肝功能損害，揭示RFA后殘余病灶的生物學(xué)活性改變，為進(jìn)一步RFA治療早期HAE小病灶及其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。RFA治療后大鼠泡球蚴病灶周邊微血管的改變、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及再次治療等問題有待于進(jìn)一步的研究。

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