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    胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的研究

    2014-08-17 08:25:54吳亞猛張琳娜陳思瑤韓景春那文婷吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院生化教研室吉林吉林3203
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒抑制率顯微鏡

    吳亞猛,張琳娜,陳思瑤,韓景春,那文婷,張 巍 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.臨床醫(yī)學(xué)院,2.生化教研室,吉林 吉林 3203)

    宮頸癌每年的新發(fā)病例平均在13萬(wàn)例以上,在世界的年發(fā)病總數(shù)中,中國(guó)占到1/3到1/4之間,而且現(xiàn)在中國(guó)宮頸癌患者的年輕化趨勢(shì)越來(lái)越明顯[1]。腫瘤細(xì)胞增殖的研究是評(píng)價(jià)化療藥效的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。胡桃醌(juglone,nuein)又名5-羥基-1,4-奈醌,是從胡桃楸新鮮根皮、枝條、青果皮中分離出來(lái)的羥基奈醌類(lèi)化合物,是胡桃楸中的主要毒性物質(zhì)[3]。為黃色針狀結(jié)晶,其熔點(diǎn)為155 ℃,微溶于熱水,易溶于氯仿和苯,溶于乙醇和乙醚,溶于堿性水溶液呈紫紅色,有升華性,具有抗腫瘤的活性,在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,可誘導(dǎo)凋亡,國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于胡桃醌抗腫瘤的報(bào)道[4]。本實(shí)驗(yàn)選用宮頸鱗癌caski細(xì)胞作為研究對(duì)象,探究胡桃醌對(duì)宮頸鱗癌的細(xì)胞毒作用,為胡桃醌的細(xì)胞毒作用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    caski細(xì)胞吉林大學(xué)藥理教研室贈(zèng)予;胡桃醌購(gòu)自sigma公司;酶標(biāo)儀為BIO-BAD公司的MODEL 550型;LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀廠);H110D電子分析天平(美國(guó)Sartorius),倒置顯微鏡(上海醫(yī)用分析儀廠)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    caski細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生小牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中,細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng),在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照,適量時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

    1.3 MTT比色法測(cè)胡桃醌的抑制率

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的caski細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞懸液密度為1×104個(gè)/mL,按100 μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板。并用胡桃醌與完全培養(yǎng)液配制成20、40、60、80、100 μmol/L不同的濃度培養(yǎng),設(shè)置不加藥的對(duì)照組和不加MTT的空白對(duì)照組,復(fù)孔數(shù)為3。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,給藥后培養(yǎng)24 h,期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT,37 ℃孵育4 h[5-6],棄去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亞砜),在搖床上低速振蕩10 min,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度值并記錄結(jié)果。利用公式計(jì)算抑制率:抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)]×100%。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    對(duì)全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

    胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的形態(tài)觀察見(jiàn)圖1。在顯微鏡下可見(jiàn)未加胡桃醌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,加胡桃醌后在顯微鏡下觀察細(xì)胞體積縮小,連接消失,與周?chē)?xì)胞脫離,生長(zhǎng)狀態(tài)極差。

    A:對(duì)照組;B:20 μmol/L;C:40 μmol/L; D:60 μmol/L E:80 μmol/L;F:100 μmol/L

    2.2 胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞增殖的影響

    不同濃度胡桃醌處理caski細(xì)胞24 h后采用MTT法測(cè)得各組吸光度,計(jì)算胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率,結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞的抑制率對(duì)胡桃醌的濃度呈明顯劑量相關(guān)性,胡桃醌的濃度分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L。以空白組做對(duì)照,測(cè)得各組OD值(見(jiàn)圖2)。從圖中可看出不同濃度胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用,各組與對(duì)照組比較有顯著差異。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞的IC50為77.27 μmol/L。

    圖 2 不同濃度胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞增殖的影響

    *P<0.05,**P<0.01

    3 討 論

    胡桃醌是從胡桃楸新鮮根皮、枝條、青果皮中分離出的羥基奈醌類(lèi)化合物,是胡桃楸中主要的毒性物質(zhì),是肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶家族成員的特異性抑制劑[7]。本實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT法對(duì)其抗增殖及誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行初步的測(cè)定,測(cè)定出胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞最佳的抑制濃度。倒置顯微鏡下可見(jiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,不同濃度胡桃醌處理后細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,生長(zhǎng)狀態(tài)差,在顯微鏡下細(xì)胞皺縮,且劑量呈依賴性。以上結(jié)果表明胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的增殖有抑制作用,但其在誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,凋亡相關(guān)基因的變化及凋亡信號(hào)的產(chǎn)生還有待深入研究,以進(jìn)一步闡述胡桃醌的作用機(jī)理。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 梁東霞,張彥娜.宮頸癌與hpv關(guān)系的研究進(jìn)展[J].實(shí)用癌癥雜志,2010,25(2):202-205.

    [2] 李 楊.中藥抗腫瘤的優(yōu)勢(shì)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006,17(4):672.

    [3] 張 巍,李 妍,呂士杰,等.不同濃度的胡桃醌對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的研究[J].上海中醫(yī)藥雜志,2012,46(6):101-103.

    [4] 趙行宇,楊 森,周麗霞,等.胡桃醌對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,39(2):255-258.

    [5] 于玲媛,李 潔.MTT法在抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞殺傷力測(cè)定中的應(yīng)用[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2006,22(5):93-95.

    [6] 趙嘉惠,張華屏,王春芳.MTT法在檢測(cè)細(xì)胞增殖方面的探討[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(3):262-263.

    [7] Seya T,Shime H,Ebihara T,et al.Pattern recognition receptors of innate immunity and their application to tumor immunotherapy[J].Cancer Sci,2010,101(2):313-320.

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