電泳技術(shù)及其臨床應(yīng)用

胡志成，孟薇薇，戴榮繼

（北京理工大學(xué)，北京 100081）

電泳（Electrophoresis, EP）是指混懸于溶液中的樣品電荷顆粒，在電場影響下向著與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。1937年，瑞典科學(xué)家Tiselius首先設(shè)計出第一臺電泳儀，在此基礎(chǔ)上建立研究蛋白質(zhì)分離的“自由界面電泳法（moving boundary electrophoresis）”，開創(chuàng)電泳技術(shù)研究的新紀元。此后，電泳技術(shù)迅速發(fā)展，各種電泳技術(shù)及相關(guān)儀器相繼問世。電泳已廣泛地應(yīng)用于分析化學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)、微生物學(xué)、食品化學(xué)等各個領(lǐng)域，在生物化學(xué)研究中占有重要地位。

1 電泳的分類

按照分離原理，電泳可分為移動界面電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳及等點聚焦電泳四大類。

1.1 移動界面電泳

移動界面電泳是不含支持物的電泳，溶質(zhì)在自由溶液中泳動，故也稱自由電泳（Free Electrophoresis）。1937年Tiselius成功地研制了界面電泳儀進行血清蛋白電泳，它是在一U型管的自由溶液中進行，電泳后用光學(xué)系統(tǒng)使各種蛋白所形成折光率差別成為曲線圖象，將血清蛋白分為白蛋白，α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白五種[1]。該法可以確定帶電物質(zhì)的遷移率，并且能用來研究混合物的組成成分，但是它不適用于研究低分子量的物質(zhì)，主要用于蛋白質(zhì)系統(tǒng)等生物大分子的研究方面。雖然它曾取得過很大的發(fā)展，但是由于設(shè)備復(fù)雜，操作時間很長，不能完全地分離混合物的各個組成等一些不可克服的缺點，已逐漸被其他電泳所代替。

1.2 區(qū)帶電泳

區(qū)帶電泳（Zone Electrophoresis）是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上電泳分離成若干區(qū)帶。又稱電色譜法，或區(qū)域離子電泳。支持介質(zhì)有多種，如濾紙、醋酸纖維膜、淀粉凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。通常在緩沖液潤濕的介質(zhì)中產(chǎn)生電場，使不同的帶電粒子以一定速率向一定方向移動，使樣品組分得到分離。分離后的各組分固定在支持介質(zhì)上，通過染色可顯示出不同的組分。

1.2.1 紙電泳

紙電泳法（Paper Electrophoresis）于20 世紀50 年代逐漸發(fā)展起來，是以濾紙作為電泳的支持介質(zhì)的一種方法。紙電泳法采用的設(shè)備簡單，應(yīng)用廣泛。最初用于蛋白質(zhì)，后來也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物質(zhì)，其優(yōu)點在于采用濾紙與色素結(jié)合的直接電泳圖，或剪下濾紙的任何部分來抽提其中的物質(zhì)。在早期的生物化學(xué)研究中，紙電泳技術(shù)曾發(fā)揮重要作用。由于紙電泳消耗時間長，分辨率較差，近年來逐漸被其它更簡便快速、分辨率高的電泳技術(shù)所代替。

1.2.2 醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis）是以醋酸纖維薄膜為支持物，于20世紀50年代發(fā)展起來的電泳技術(shù)。該方法具有以下優(yōu)點：①對蛋白質(zhì)樣品吸附少，無“拖尾”現(xiàn)象；②分離速度快，電泳時間短；③靈敏度高，樣品用量少；④醋酸纖維薄膜染色后背景能完全脫色，各蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，從而提高測定的精確性。但由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，必須在密閉的容器中進行電泳，并使用較低壓電流避免蒸發(fā)。目前醋酸纖維素薄膜電泳已經(jīng)廣泛用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，類固醇激素及同工酶等的分離分析中，盡管它的分辨率比聚丙酰胺凝膠電泳低，但它具有簡單，快速等優(yōu)點[2]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

20世紀60年代，聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）得到發(fā)展。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前能根據(jù)分子大小和凈電荷多少這兩種物理性質(zhì)差別來分離分子的較好方法。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由Shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀Ｓ捎谀z的孔徑大小可根據(jù)待分離樣品物質(zhì)分子的大小來確定，故有較高的分辨率。它除了能作定性、定量分析外，還可以用來測定分子量。

1.3 等電點聚焦電泳

等電點聚焦（Isoelectric FocusingElectrophoresis，IEF）是于20世紀60年代中期出現(xiàn)的技術(shù)。該方法利用一種特殊的緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷），形成一個很窄的區(qū)帶。將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。

等電點聚焦克服了一般電泳易擴散的缺點。近年來，等電點聚焦電泳又有了新的進展，可以分辨等電點只差0.001pH單位的生物分子。由于它的操作簡便迅速、分辨力高、重復(fù)性好、樣品容量大，在生物化學(xué)、分類學(xué)、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究等諸方面，都得到廣泛應(yīng)用。

1.4 等速電泳

等速電泳（Isotachophoresis）是20世紀70年代初在普通自由界面電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新新的高效電泳技術(shù)，是一種用于分離具有不同凈電荷數(shù)的分子的方法。等速電泳是在樣品中加入一種高遷移率離子（其遷移率比被分離離子大）和一種低遷移率離子（其遷移率比被分離的離子?。瑯悠芳釉诟哌w移率離子和低遷移率離子之間，在外電場作用下，使不同離子進行移動。經(jīng)過電泳后，達到完全分離。被分離的不同離子的區(qū)帶按遷移率大小依次排列在高遷移率離子與低遷移率離子的區(qū)帶之間。它可以在一個水平的或垂直的平面上進行（取決于所用儀器）。進行分離的溶液一般是含水的介質(zhì)。在具體的操作方法上，等速電泳可分為制備型和毛細管型。前者可用于毫克量范圍內(nèi)樣品的分離分析；后者則可用于微克量范圍內(nèi)樣品的定量分析[3]。等速電泳具有高靈敏度、高分辨率、重現(xiàn)性好及消耗時間短等優(yōu)點。

2 電泳技術(shù)的臨床應(yīng)用

隨著電泳技術(shù)的相繼出現(xiàn)，各種電泳分析儀被引入臨床實驗室，并在臨床疾病的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用，為各種蛋白質(zhì)的檢測及其對各種疾病的反應(yīng)提供新的手段和依據(jù)。

2.1 血清蛋白電泳

人血漿中含有許多中蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在正常成人體內(nèi)分布均勻程度極高，而當人處在疾病狀態(tài)時，血漿中蛋白組分含量會發(fā)生較大的變化[4]。根據(jù)不同血清蛋白具有不同的表面電荷，根據(jù)電泳能夠?qū)Φ鞍走M行有效的分離，并分析蛋白含量的變化，從而反映患者的身體狀態(tài)。

1937年，Tiselius提出血清蛋白的電泳分離方法，成功將血清蛋白分離得到五種蛋白。但是由于其分離效果不顯著，靈敏度較低，且耗費大，在臨床應(yīng)用上受到較大的限制。隨著科技的發(fā)展，電泳技術(shù)愈加成熟，出現(xiàn)了靈敏度高，操作簡單的電泳技術(shù)，并被應(yīng)用于臨床檢測上。醋酸纖維薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)，供臨床上診斷肝、腎等疾病參考。新鮮血清經(jīng)電泳分析后，可以準確地描繪出病患蛋白質(zhì)的全貌。一般是白蛋白含量的降低，某個球蛋白區(qū)域發(fā)生升高或降低，從而反映患者的身體狀態(tài)。

血清含有各種蛋白質(zhì)，其等電點均在pH7.5以下，若置于pH8以上的緩沖液電泳時均游離成負離子，向正極移動。由于其等電點，分子量和分子形狀各不相同，其電泳速度不同。按其游動速度順序把血清蛋白粗略分為清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白。臨床上血清白蛋白的減少與γ球蛋白增高為肝病患者血清蛋白電泳所共有的現(xiàn)象，其減少與增加的程度和肝炎的損傷的范圍相并行。急性炎癥時，可見α1、α2區(qū)百分率升高；腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現(xiàn)白蛋白下降，α2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺鐵性貧血時可由于轉(zhuǎn)鐵蛋白的升高而呈現(xiàn)β區(qū)帶增高[5]。

此外，血清蛋白電泳檢測在非霍奇金淋巴瘤（nonhodgkin’s lymphoma，NHL）的臨床診斷上也具有一定意義。非霍奇金淋巴瘤是一組常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，大部分為B細胞。NHL已發(fā)生早期遠處擴散，有的病例在臨床確診時已播散至全身。溫冠輝等[6]使用毛細管電泳，分離出的正常血清蛋白電泳可以分為6條區(qū)帶即：清蛋白帶、α1區(qū)帶、α2區(qū)帶、β1區(qū)帶、β2區(qū)帶及γ區(qū)帶。NHL患者血清蛋白電泳結(jié)果顯示，α1區(qū)結(jié)果顯著升高，α2區(qū)及格過明顯升高，β1區(qū)結(jié)果顯著降低，而清蛋白、β2、γ區(qū)帶蛋白結(jié)果變化不明顯。通過血清蛋白電泳，觀察各蛋白區(qū)帶結(jié)果變化，可能對NHL的診斷提供一定參考。

因此，通過電泳技術(shù)分析血清蛋白的變化，對疾病診斷和預(yù)后的評估具有重要的臨床意義。

2.2 尿蛋白電泳

腎小球疾病是引起腎功能衰竭的主要原因。在正常生理情況下，由于孔徑屏障、電荷屏障及球內(nèi)系膜組成的腎小球濾過屏障的作用，尿液中蛋白含量甚微。當腎小球通透性增高或濾膜受損，腎小管重吸收能力減弱，腎或其他組織分泌增加時，即產(chǎn)生蛋白尿。蛋白尿的選擇性指數(shù)可以描述腎小球?qū)Υ蠓肿油ㄍ感缘母淖?。通過電泳分析尿蛋白的蛋白質(zhì)組成，可幫助分析蛋白尿性質(zhì)來源，從而有助于病因診斷和預(yù)后判斷[7～9]。

尿蛋白電泳的主要目的是在無損傷情況下，協(xié)助臨床分析判斷腎臟病變的程度。尿蛋白電泳取材方便，無創(chuàng)傷性，且敏感度高，這樣可以避免進行腎活檢，從而減輕病人痛苦。目前主要采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）及用十二磺基磺酸鈉-瓊脂糖凝膠（SDSAGE）進行非濃縮尿蛋白電泳檢測。

尿蛋白與SDS反應(yīng)，形成帶有大量負電荷的復(fù)合物，帶上的大量負電荷，大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，從而掩蓋各種蛋白質(zhì)原有的電荷差異，使得蛋白質(zhì)的遷移率僅僅反映蛋白質(zhì)壓機相對分子量的差別。通過電泳，將蛋白質(zhì)按照相對分子量大小順序，分離出蛋白質(zhì)區(qū)帶，從而對蛋白尿進行分型[10]。尿蛋白電泳呈現(xiàn)出的中、高分子蛋白區(qū)帶主要是反映腎小球病變，而呈現(xiàn)出低分子蛋白區(qū)帶是反映腎小管病變或溢出性蛋白尿；混合型蛋白尿經(jīng)過電泳可見到各種區(qū)帶。尿蛋白對臨床癥狀不明顯及輕度蛋白尿患者的病情診斷及腎臟疾病在治療過程中病情的動態(tài)分析也具有很大價值。

此外，尿蛋白電泳在糖尿病腎病的檢測應(yīng)用具有重要的臨床意義。糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，是糖尿病人死亡的重要原因。糖尿病腎病發(fā)病隱匿，逐漸引起全身的小動脈硬化病變，腎臟為最常受累的靶器官之一，并可累及腎小球和腎小管，在沒有治療干預(yù)情況下，微量清蛋白尿患者在七年內(nèi)有50%進入尿毒癥期[11]。而通過非濃縮尿蛋白電泳，可以較直觀地了解尿蛋白的組分及腎臟受損部位和程度，對腎損害的早期定位、鑒別診斷、指導(dǎo)治療及預(yù)后判斷具有臨床價值[12]。

2.3 腦脊液蛋白電泳

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎癥與一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CNS具有免疫活性，并且與外周免疫系統(tǒng)相互作用。腦脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）檢查對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病的鑒別診斷、病情觀察、指導(dǎo)應(yīng)用等方面能提供重要依據(jù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，顱內(nèi)和椎管的疾病變化急劇，需要正確的診斷和積極的治療，而對血腦屏障的完整性評價以及對椎管內(nèi)和顱內(nèi)炎性病變的診斷，需要依賴于CSF內(nèi)相關(guān)特征性指標的檢驗。當疾病發(fā)生時一些血清蛋白質(zhì)成分可以在CSF中出現(xiàn)，在CSF中含量最豐富、檢測最容易的蛋白質(zhì)是白蛋白，其次則是IgG?，F(xiàn)階段臨床上診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變主要依靠影像學(xué)結(jié)合臨床分析，但對某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變，如多發(fā)性硬化、格林巴氏綜合癥，早期診斷非常困難，病變早期影像學(xué)及常規(guī)檢查無法診斷，而患者腦脊液中免疫球蛋白IgG增加發(fā)生早，腦脊液蛋白電泳IgG形成典型寡克隆區(qū)帶，是早期診斷重要的、不可少的依據(jù)[13～15]。

腦脊液中的寡克隆區(qū)帶、IgG鞘內(nèi)合成率的變化也可為診斷神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病提供依據(jù)，二者的聯(lián)合檢測可提高神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的診斷陽性率。由于該方法特異性較高，敏感性強，國外學(xué)者也將腦脊液寡克隆區(qū)帶區(qū)及IgG鞘內(nèi)合成率聯(lián)合檢測作為早期診斷多發(fā)性硬化的實驗室指標[16]。

此外，腦脊液寡克隆區(qū)帶在神經(jīng)精神性狼瘡早期診斷中具有臨床意義。神經(jīng)精神性狼瘡臨床診斷困難，有研究顯示當系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并神經(jīng)系統(tǒng)病變時可有腦脊液壓力、蛋白、細胞數(shù)的增高，還有免疫球蛋白、抗核抗體等改變。而患者腦脊液免疫球蛋白IgG增加發(fā)生早，且更具有特異性，腦脊液蛋白電泳IgG形成典型寡克隆區(qū)帶。腦脊液寡克隆區(qū)帶是經(jīng)過免疫固定電泳后在腦脊液泳道中出現(xiàn)的異常條帶，可以明確判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性合成免疫球蛋白的存在。且檢測結(jié)果表明神經(jīng)精神性狼瘡患者較對照組，腦脊液的寡克隆區(qū)帶陽性率明顯升高，從而間接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)過程的強烈程度，對神經(jīng)精神性狼瘡的早期發(fā)現(xiàn)提供臨床依據(jù)[17]。

目前腦脊液蛋白質(zhì)電泳通常用瓊脂糖凝膠或醋酸纖維薄膜作為載體，若采用等電聚焦電泳可提高電泳圖譜的分辨率。由于腦脊液中蛋白質(zhì)含量少，因此在電泳前須將腦脊液標本在高分子聚乙二醇或右旋糖苷透析液中濃縮。近年來應(yīng)用高效毛細管電泳法進行腦脊液蛋白質(zhì)電泳分析可進一步提高分辨率且腦脊液標本無需濃縮。

2.4 同工酶電泳

在動、植物中，一種酶的同工酶在各組織、器官中的分布和含量不同，形成各組織特異的同工酶譜，叫做組織的多態(tài)性，體現(xiàn)各組織的特異功能。同工酶電泳在臨床上被用于同工酶或同工酶亞型的分析。

用瓊脂糖凝膠電泳法（Agarose Gel Electrophoresis,AGE）將乳酸脫氫酶同工酶分離，得到5種同工酶區(qū)帶（LDH1～LDH5）?？捎糜谠\斷為急性心肌梗塞（當LDH1＞LDH2）及骨骼肌疾病（LDH5升高）的診斷鑒別。而當惡性腫瘤及肝硬化時，可發(fā)現(xiàn)LDH5明顯升高，或者在胸腹水電泳中出現(xiàn)一條異常的LDH6區(qū)帶。

采用瓊脂糖凝膠電泳法可分離出三種肌酸激酶（CreatineKinase, CK）同工酶。心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）是肌酸激酶同工酶中的一種，主要分布于心肌中，可作為心肌梗死的早期血清酶學(xué)診斷指標。凝膠電泳分析是鑒定心肌型肌酸激酶同工酶最常用的方法。當在臨床中遇到患者血清 CK-MB活性高于正常，且占總心肌型肌酸激酶活性超過 30%時，一般不是心肌損傷所致，可進行同工酶電泳分析，以確定病因和明確診斷[18]。

堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）主要用于肝、膽及骨骼疾病的診斷和鑒別診斷。通過測定ALP總活性及其同工酶對引起ALP活性增高的疾病具有診斷和鑒別診斷的意義[19]。采用瓊脂糖凝膠電泳法可對ALP同工酶進行常規(guī)快速分析，對疾病的診斷提供依據(jù)。

2.5 脂蛋白電泳

脂蛋白電泳主要用于高脂蛋白血癥分型，也有助于了解冠心病的血脂狀態(tài)，更好地指導(dǎo)臨床診療工作。利用脂蛋白中所含載脂蛋白電荷的不同、顆粒大小不同以及分子量、等電點的不同，通過電泳法將各種脂蛋白分成4大類：乳糜微粒（CM）、前-β脂蛋白、β-脂蛋白和α-脂蛋白，分別相當于超速離心法分離的乳糜微粒、極低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白(LDL）和高密度脂蛋白（HDL）[20]。

脂質(zhì)代謝紊亂與冠心病的發(fā)生關(guān)系密切。低密度脂蛋白和高密度脂蛋白是膽固醇（C）主要的轉(zhuǎn)運體，LDL是冠心病的重要危險因素，HDL冠心病的發(fā)生呈負相關(guān)。LDL-C/HDL-C比值是冠心病重要危險因子之一，隨著比值的增大，冠心病的危險性相應(yīng)增大。通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合酶顯色法，將膽固醇脂蛋白分離，分析LDL-C及HDL-C水平，有利于臨床做出準確判斷，做好冠心病的預(yù)防工作，從而降低死亡率[21]。

3 展望

隨著時代的進步，電泳技術(shù)也不斷發(fā)展，在各方面的應(yīng)用也愈加廣泛。電泳技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用，為各種疾病的診斷及患者病情的動態(tài)分析等提供了更為便捷、直觀的方法。隨著電泳技術(shù)的不斷改進及發(fā)展，電泳技術(shù)在臨床研究應(yīng)用與疾病的診斷、鑒別診斷等方面提供更準確、更快捷的分析方法，電泳技術(shù)也必將越來越受到臨床醫(yī)學(xué)的青睞。

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