口腔細(xì)胞采集卡DNA分型快速檢驗(yàn)?zāi)Ｊ降慕?/h1>
2014-04-23 05:19:54魏福軍張建王天華田田賈世友伊莎莎郭玉秋
生命科學(xué)儀器 2014年4期
魏福軍，張建，王天華田，田賈世友，伊莎莎，郭玉秋
（1. 大慶市公安（局南刑京事航技空術(shù)航支天隊(duì)大，學(xué)黑 龍生江物大醫(yī)慶學(xué) 工16程33系11，；江2. 蘇公省安 部南物京證市鑒 21定00中16心），北京 100038）
近些年來(lái)， DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)和應(yīng)用，極大提升了公安機(jī)關(guān)打擊犯罪的效能。DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)業(yè)已成為目前法庭科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的重中之重，DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的規(guī)模及內(nèi)存容量也在逐年擴(kuò)大[1,2]。當(dāng)前，DNA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本的檢驗(yàn)主要包括樣本采集、樣本直接擴(kuò)增、DNA檢測(cè)三個(gè)主要步驟。樣本采集主要是指各地公安機(jī)關(guān)對(duì)違法犯罪人員及相關(guān)涉案人員進(jìn)行身份信息和相應(yīng)生物樣本采集。傳統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)樣本主要以血卡為主，針對(duì)該類樣本，各DNA實(shí)驗(yàn)室均已建立的成熟的DNA檢驗(yàn)流程，檢驗(yàn)成功率高、檢驗(yàn)速度快。與此同時(shí)，近年來(lái)口腔細(xì)胞樣本采集卡由于具備使用方法簡(jiǎn)單、被采集者無(wú)創(chuàng)無(wú)痛等特點(diǎn)，能夠避免基層民警取樣帶來(lái)不必要的糾紛，因此，在有些地區(qū)口腔細(xì)胞樣本采集卡正逐漸替代傳統(tǒng)的血樣采集。然而，該類樣本的檢驗(yàn)也存在一系列問(wèn)題：第一，無(wú)法準(zhǔn)確定位口腔細(xì)胞采集卡上口腔細(xì)胞的位置；第二，口腔細(xì)胞在采集卡上分布不均，存在著取樣時(shí)取不到細(xì)胞造成初檢成功率低的情況[3,4]。有鑒于此，目前口腔細(xì)胞的檢驗(yàn)仍是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題，針對(duì)該類樣本的檢測(cè)主要還是以DNA自動(dòng)化提取后再進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)的方法為主，這種方式費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、同時(shí)耗費(fèi)大量辦案經(jīng)費(fèi)。本研究通過(guò)采用小孔徑生物樣本自動(dòng)打孔儀多點(diǎn)取樣的方式，結(jié)合DNATyperTM19試劑盒對(duì)口腔細(xì)胞樣本進(jìn)行直接擴(kuò)增，初檢成功率達(dá)到98%，極大提高了口腔細(xì)胞卡類樣本的批量檢驗(yàn)效率，解決了困擾法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室的口腔卡類數(shù)據(jù)庫(kù)樣本的檢驗(yàn)難題。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)樣本
本實(shí)驗(yàn)室日常積累的違法犯罪人員口腔細(xì)胞采集卡樣本（博坤公司研制）200份。
1.2 主要試劑
DNATyperTM19試劑盒（公安部物證鑒定中心，中國(guó)）。
1.3 主要儀器
BSD600型半自動(dòng)打孔儀（BSD公司）、BIOMEK-NXP、BIOMEK-3000自動(dòng)化工作站2臺(tái)（貝克曼公司）、9700型擴(kuò)增儀（AB公司）、3130XL型基因分析儀（AB公司）。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1PCR反應(yīng)液分裝
按照DNATyperTM19試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR擴(kuò)增試劑，利用BIOMEK-NXP自動(dòng)化工作站將按每孔10μL試劑加入到96孔擴(kuò)增板中。
1.3.2口腔細(xì)胞采集卡樣本取樣
設(shè)置BSD600型半自動(dòng)打孔儀運(yùn)行參數(shù)，使之在口腔細(xì)胞采集卡樣本上打孔取樣，選擇靠近棉簽轉(zhuǎn)印區(qū)的部位，打下2至3片1.0mm的樣本，置于已加入反應(yīng)液的96孔擴(kuò)增板中離心，待打取的樣本完全浸入擴(kuò)增試劑后擴(kuò)增。
1.3.3擴(kuò)增反應(yīng)
95℃11分鐘；94℃30秒，59℃2分鐘，72℃1分鐘，28個(gè)循環(huán)；60℃60分鐘，25℃保存。
1.3.4電泳前加樣
使用 BIOMEK-3000自動(dòng)化工作站對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物按照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μL與9μL上樣混合物比例混合后進(jìn)行加樣電泳。
1.3.5電泳檢測(cè)及STR分型
通過(guò)3 1 3 0 X L型遺傳分析儀電泳分離后，采用GeneMaperID v3.2分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 結(jié)果
通過(guò)采用生物樣本自動(dòng)打孔儀小孔徑多點(diǎn)取樣的方式，結(jié)合DNATyperTM19試劑盒對(duì)200份違法人員口腔細(xì)胞樣本進(jìn)行批量化直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，其中196份樣本得到了完整的STR分型，初檢成功率高達(dá)98%（部分樣本分型見(jiàn)圖1），檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)pull-up峰、非特異性人工產(chǎn)物等現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，未獲完整分型的4個(gè)樣本，再次使用相同的檢驗(yàn)方式后獲得完整分型（數(shù)據(jù)未列出）。
2.2 討論
圖1部分口腔細(xì)胞采集卡樣本的STR分型結(jié)果Fig.1Example of STR genotyping of buccal cell samples
張建等的研究表明，市售的口腔細(xì)胞采集卡含有熒光成分，直接擴(kuò)增檢驗(yàn)過(guò)程中，樣本量過(guò)大會(huì)對(duì)樣本的部分分型有熒光干擾[5]。本研究基于已有研究數(shù)據(jù)和本實(shí)驗(yàn)室的建庫(kù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，采用生物樣本自動(dòng)打孔儀小孔徑多點(diǎn)取樣的方式結(jié)合應(yīng)用DNATyperTM19試劑盒對(duì)口腔細(xì)胞采集卡樣本進(jìn)行直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，避免了DNA提取等操作，極大簡(jiǎn)化了檢驗(yàn)流程，節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間和成本，且具備98%以上的初檢成功率。BSD600型半自動(dòng)打孔儀能夠同時(shí)打出兩片相同或不同尺寸的圓紙片，具有的光定位設(shè)備可以自動(dòng)根據(jù)選擇的打子孔數(shù)量及孔徑準(zhǔn)確定位，大幅增加通量，縮短工作時(shí)間。使用打孔儀的小孔徑取樣，避免了取樣量過(guò)大造成的擴(kuò)增干擾物的影響；多點(diǎn)取樣的操作，增加了取準(zhǔn)細(xì)胞的幾率，提高了初檢成功率（本研究中未獲完整分型的4個(gè)樣本，復(fù)檢后獲得完整分型，也從另一個(gè)方面證明了這一觀點(diǎn)）。另外，本實(shí)驗(yàn)室使用的DNATyperTM19試劑盒可以同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)18個(gè)STR基因座以及Amelogenin性別基因座，完全滿足國(guó)家DNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)位點(diǎn)數(shù)的要求[6～8]，本文研究建立的口腔細(xì)胞采集卡DNA分型快速檢驗(yàn)?zāi)Ｊ侥軌驅(qū)崿F(xiàn)檢驗(yàn)我省普遍應(yīng)用的口腔細(xì)胞采集卡的高效、快速檢驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便易行，進(jìn)而節(jié)約了建庫(kù)成本，對(duì)我省DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)和法治建設(shè)有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
[1] 趙興春, 葉健. 法庭DNA技術(shù)的發(fā)展及展望. 刑事技術(shù), 1998(5):42- 46.
[2] 葛百川, 郭紅玲, 王穗保. 美國(guó)、加拿大DNA數(shù)據(jù)庫(kù)概況及我國(guó)建立DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的思考. 刑事技術(shù), 2001(4): 7-9.
[3] Dennis Y W, Chien W C, Nicola J O,et al.Direct amplification of STRs from blood or buccal cell samples. For ensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2(1): 113- 114.
[4] Dennis Y W, Chien W C, Lori K H. Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2h. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2( 1) : 115- 116.
[5] 張建, 姜成濤, 趙興春, 等. DNATyperTM15試劑盒直接擴(kuò)增檢驗(yàn)紙質(zhì)樣本的研究. 刑事技術(shù), 2011(4): 33-35.
[6] 趙興春, 姜成濤, 葉健, 等. DNATyperTM15試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 23(3): 169-171.
[7] 張建, 趙興春, 王樂(lè), 等. 應(yīng)用DNATyper15TMPlus試劑盒對(duì)遵義地區(qū)漢族人群18個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性的調(diào)查.法醫(yī)遺傳學(xué)應(yīng)用與進(jìn)展, 2012: 176-180.
[8] 鄭秀芬. 法醫(yī)DNA 分析. 北京: 中國(guó)人民公安大學(xué)出版, 2002:385-387.
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1.3.3擴(kuò)增反應(yīng)
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1.3.4電泳前加樣
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1.3.5電泳檢測(cè)及STR分型
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2 結(jié)果與討論
2.1 結(jié)果
通過(guò)采用生物樣本自動(dòng)打孔儀小孔徑多點(diǎn)取樣的方式，結(jié)合DNATyperTM19試劑盒對(duì)200份違法人員口腔細(xì)胞樣本進(jìn)行批量化直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，其中196份樣本得到了完整的STR分型，初檢成功率高達(dá)98%（部分樣本分型見(jiàn)圖1），檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)pull-up峰、非特異性人工產(chǎn)物等現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，未獲完整分型的4個(gè)樣本，再次使用相同的檢驗(yàn)方式后獲得完整分型（數(shù)據(jù)未列出）。
2.2 討論
圖1部分口腔細(xì)胞采集卡樣本的STR分型結(jié)果Fig.1Example of STR genotyping of buccal cell samples
張建等的研究表明，市售的口腔細(xì)胞采集卡含有熒光成分，直接擴(kuò)增檢驗(yàn)過(guò)程中，樣本量過(guò)大會(huì)對(duì)樣本的部分分型有熒光干擾[5]。本研究基于已有研究數(shù)據(jù)和本實(shí)驗(yàn)室的建庫(kù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，采用生物樣本自動(dòng)打孔儀小孔徑多點(diǎn)取樣的方式結(jié)合應(yīng)用DNATyperTM19試劑盒對(duì)口腔細(xì)胞采集卡樣本進(jìn)行直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，避免了DNA提取等操作，極大簡(jiǎn)化了檢驗(yàn)流程，節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間和成本，且具備98%以上的初檢成功率。BSD600型半自動(dòng)打孔儀能夠同時(shí)打出兩片相同或不同尺寸的圓紙片，具有的光定位設(shè)備可以自動(dòng)根據(jù)選擇的打子孔數(shù)量及孔徑準(zhǔn)確定位，大幅增加通量，縮短工作時(shí)間。使用打孔儀的小孔徑取樣，避免了取樣量過(guò)大造成的擴(kuò)增干擾物的影響；多點(diǎn)取樣的操作，增加了取準(zhǔn)細(xì)胞的幾率，提高了初檢成功率（本研究中未獲完整分型的4個(gè)樣本，復(fù)檢后獲得完整分型，也從另一個(gè)方面證明了這一觀點(diǎn)）。另外，本實(shí)驗(yàn)室使用的DNATyperTM19試劑盒可以同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)18個(gè)STR基因座以及Amelogenin性別基因座，完全滿足國(guó)家DNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)位點(diǎn)數(shù)的要求[6～8]，本文研究建立的口腔細(xì)胞采集卡DNA分型快速檢驗(yàn)?zāi)Ｊ侥軌驅(qū)崿F(xiàn)檢驗(yàn)我省普遍應(yīng)用的口腔細(xì)胞采集卡的高效、快速檢驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便易行，進(jìn)而節(jié)約了建庫(kù)成本，對(duì)我省DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)和法治建設(shè)有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
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[4] Dennis Y W, Chien W C, Lori K H. Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2h. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2009, 2( 1) : 115- 116.
[5] 張建, 姜成濤, 趙興春, 等. DNATyperTM15試劑盒直接擴(kuò)增檢驗(yàn)紙質(zhì)樣本的研究. 刑事技術(shù), 2011(4): 33-35.
[6] 趙興春, 姜成濤, 葉健, 等. DNATyperTM15試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 23(3): 169-171.
[7] 張建, 趙興春, 王樂(lè), 等. 應(yīng)用DNATyper15TMPlus試劑盒對(duì)遵義地區(qū)漢族人群18個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性的調(diào)查.法醫(yī)遺傳學(xué)應(yīng)用與進(jìn)展, 2012: 176-180.
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