LC-MS/MS法測定人血漿中ASE濃度

朱 軍，陳琴華，熊 琳，余 飛，李夢穎，李 鵬

0 引言

亮菌甲素琥珀酸單酯(ASE)是采用前藥的設(shè)計方法，用琥珀酸酐將其結(jié)構(gòu)中的羥甲基酰化制成琥珀酸單酯，改善其水溶性。前期研究表明，亮菌甲素琥珀酸單酯增加膽汁分泌的作用強于亮菌甲素，對總膽管末端括約肌具有松弛效應(yīng)，有望成為一種優(yōu)良的肝膽用藥[1-2]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI/MSn)法是近年發(fā)展起來的適用于生物樣品定性定量分析的一種方法，具有靈敏度高、專屬性強、簡便快速的優(yōu)點，能夠進行在線分離和檢測[3-4]。本文采用LC-MS/MS法測定ASE在人血漿中的含量，為進一步研究其藥動學(xué)及其生物等效性實驗提供新的思路。

1 材料與儀器

亮菌甲素琥珀酸單酯對照品(本研究所合成，批號：20090422，純度99.6%)；補骨脂甲素對照品(上海順博生物科技有限公司，批號：20100302，純度98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；乙酸銨、乙酸、三氯甲烷和乙醚為分析純。

十萬分之一分析天平(Sartorius CP225D型，0.1 mg)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent 公司產(chǎn)品，包括電噴霧離子化源(ESI)、LC/MS trap software 4.2工作站、DataAnalysis version 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，具有軟電離和多級離子阱質(zhì)譜功能；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司)；HP-01溶劑過濾器(杭州賽析科技有限公司)；日本島津AEU-210電子天平；TG16G離心儀；WH-1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；超速離心機(杭州賽析科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取ASE對照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，即得1.0 mg/mL ASE儲備液，置冰箱冷藏備用。精密吸取配制好的ASE儲備液1.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，即得ASE工作液(濃度為100 μg/mL)。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取補骨脂甲素對照品(批號：20100302)10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇超聲溶解后稀釋至刻度，即得補骨脂甲素對照品儲備液(濃度為1.0 mg/mL)，置冰箱冷藏備用。精密吸取補骨脂甲素對照品儲備液1.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，即得補骨脂甲素工作液(濃度為50 μg/mL)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱(30 mm×2.1 mm，3.5 μm)。流動相：甲醇(A)-20 mM乙酸銨水溶液梯度洗脫：5%A，1 min；1～4 min線性增加到95%A，保持8 min；最后降至5%A，并且基線平衡。流速：0.4 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量：20 μL。負(fù)離子模式下監(jiān)測，監(jiān)測離子分別為m/z333→233(ASE)和m/z323→221(內(nèi)標(biāo))。

2.3 樣品預(yù)處理[5]取空白人血漿0.5 mL于10 mL具塞試管中，分別加入ASE(100 μg/mL)和內(nèi)標(biāo)溶液(50 μg/mL)各50 μL，加入1%鹽酸100 μL，渦旋振搖0.5 min，加入三氯甲烷-乙醚(v∶v，1∶1)5.0 mL，渦旋振搖1.0 min，4 000 r/min離心10 min，精密吸取離心后的上清液4.0 mL，40 ℃條件下氮吹儀氮氣吹干，加入100 μL甲醇超聲使溶解完全，10 000 r/min離心10 min，精密吸取20 μL該上清液進樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白人血漿0.5 mL，精密加入一定量ASE對照品溶液(100 μg/mL)，置10 mL具塞試管中，配制系列血漿樣品，其中含ASE濃度為0.01、0.05、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/mL，按“2.3”項下樣品處理方法處理后進行測定。以ASE和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對血漿濃度X進行線性回歸，回歸方程：Y=0.863×10-3X+0.352，相關(guān)系數(shù)r=0.991 4，結(jié)果表明，ASE在0.01～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度均為0.5 ng/mL(S/N>3)。專屬性色譜圖見圖1，其保留時間分別為 6.1、7.5 min。表明該方法專屬性強，空白血漿對測定無干擾。

2.5 回收率和精密度試驗 提取回收率：取人空白血漿溶液0.5 mL，分別精密加入一定量對照品溶液(1.0 μg/mL)和內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3項”處理樣品，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，測得的結(jié)果用外標(biāo)法計算回收率，結(jié)果ASE提取回收率為82%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為90%。

圖1 色譜圖

加樣回收率和精密度：取人空白血漿溶液0.5 mL，精密加入一定量對照品溶液(濃度分別為0.05、1.0、5.0 μg/mL)，按“2.3”項處理樣品，作為質(zhì)控樣品，制備每個濃度的質(zhì)控樣品各5份，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，測得結(jié)果用ASE和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值表示，帶入回歸方程計算回收率。同時考察1 d內(nèi)制備3個濃度的質(zhì)控樣品，每個樣品測定5次，計算RSD(日內(nèi)精密度)，以及在同一周內(nèi)不同日內(nèi)分別測定，計算RSD(日間精密度)。見表1。

表1 ASE在人血漿中的加樣回收率和精密度(μg/mL)

2.6 穩(wěn)定性試驗 分別制備3個濃度的質(zhì)控樣品各10份，分為2組，一組在25 ℃保存2 h，一組在-20 ℃保存1個月，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，測得結(jié)果與第1天結(jié)果比較，表明ASE可以在25 ℃下2 h和-20 ℃下1個月保存，見表2。

表2 ASE在人血漿中的穩(wěn)定性試驗

3 討論

ASE分子結(jié)構(gòu)式中具有羧基，屬于弱酸性化合物，更易失去氫離子，在LC-MS分析中，易于負(fù)離子檢測，離子檢測極性和pH選擇的規(guī)則需要滿足：酸性樣品、增加pH值、pH值至少高于樣品pKa 2個單位。流動相中的添加劑(乙酸銨、甲酸銨、乙酸、甲酸等)可以增加樣品在ESI中的離子化效率，使用乙酸銨和甲酸銨雖然可以增加ASE在ESI中的離子化效率，但是影響其在LC中的峰形，進一步試驗發(fā)現(xiàn)，使用乙酸銨既可以增加其在ESI中的離子化效率，又可得到相對對稱的色譜峰形[6-7]。本實驗以5、10、15、20、25和30 mM乙酸銨作為添加劑，考察其分離和離子化效率，結(jié)果表明，乙酸銨濃度>25 mM時，ASE的離子化效率降低，因此，本實驗選用20 mM乙酸銨作為流動相添加劑。

參考文獻：

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[2] 陳琴華,朱軍,李鵬.電噴霧離子阱質(zhì)譜檢測亮菌甲素琥珀酸單酯的負(fù)離子裂解途徑[J].中國藥業(yè),2012,21(22):42-44.

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[7] 陳琴華,李鵬,朱軍.液-質(zhì)聯(lián)用法測定補需顆粒中升麻素苷的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(2):101-103.