貴州阿哈湖沉積物中硫酸鹽還原菌的時(shí)空分布特征

張　偉

(1貴州師范學(xué)院　地理與旅游學(xué)院，貴州　貴陽　550018；2中國科學(xué)院　地球化學(xué)研究所　環(huán)境地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州　貴陽　550081)

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貴州阿哈湖沉積物中硫酸鹽還原菌的時(shí)空分布特征

張偉1，2

(1貴州師范學(xué)院地理與旅游學(xué)院，貴州貴陽550018；2中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550081)

摘要：利用PCR擴(kuò)增和熒光原位雜交方法對(duì)貴州阿哈湖沉積物中硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria，SRB)類群和數(shù)量的時(shí)空分布特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，秋季沉積物中檢測(cè)出四個(gè)SRB類群(脫硫腸菌屬、脫硫葉菌屬、脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬和脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬)，而春季沉積物中只檢測(cè)出三個(gè)類群(脫硫腸菌屬、脫硫葉菌屬和脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬)。相比秋季，春季沉積環(huán)境溶解氧含量較高，且溫度較低，這可能導(dǎo)致脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬在春季沉積物中處于不可育狀態(tài)，由于其活性低而無法檢測(cè)。秋季沉積物檢測(cè)出來的SRB類群相比春季沉積物具有更大的分布范圍，同時(shí)，秋季沉積物SRB數(shù)量總體上高于春季沉積物，上述結(jié)果指示秋季沉積物環(huán)境條件更適于SRB群落。

關(guān)鍵詞：硫酸鹽還原菌；時(shí)空分布；PCR擴(kuò)增；熒光原位雜交；阿哈湖

0引言

湖泊是人類生活和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需淡水的重要來源，其水環(huán)境質(zhì)量是影響人類生命健康的重要因素。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，礦山開發(fā)、工農(nóng)業(yè)和生活廢污水排放等各種人為活動(dòng)對(duì)湖泊環(huán)境的影響日益突出。阿哈湖是位于貴陽市西南郊約8 km的一個(gè)底層滯水季節(jié)性缺氧的人工水庫。匯水區(qū)域內(nèi)分布有大小煤礦200余個(gè)，大量酸性礦坑廢水長(zhǎng)期入湖，下游又接納生活污水，導(dǎo)致阿哈湖呈現(xiàn)重金屬、營養(yǎng)鹽和硫酸鹽復(fù)合型污染的水體環(huán)境[1]。巖溶地區(qū)湖泊具有強(qiáng)烈的酸緩沖能力，僅在煤礦廢水污染下，微量金屬元素易與還原態(tài)硫化物結(jié)合而固定在沉積物中，但在持續(xù)有機(jī)污染輸入的情況下，則可能改變沉積物的氧化還原環(huán)境，容易使一些有害金屬活化，重新遷移并造成嚴(yán)重的“二次污染”問題，嚴(yán)重威脅到湖泊/水庫的水質(zhì)安全[2]。

硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria，SRB)是一大類厭氧菌，不同的SRB類群具有不同的生理生化和系統(tǒng)發(fā)育特征[3]。由于這些生理生化和系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，SRB棲息于不同的環(huán)境介質(zhì)，其驅(qū)動(dòng)的硫酸鹽異化還原反應(yīng)是湖泊環(huán)境中SO42-的主要清除機(jī)制，主要發(fā)生在水—沉積物界面及以下深度的沉積物厭氧環(huán)境[4]，對(duì)湖泊環(huán)境碳和硫的循環(huán)起著重要作用[5]。另外，硫酸鹽還原反應(yīng)生成的硫化物可以和溶解態(tài)金屬離子結(jié)合形成不溶性金屬沉淀，所以SRB在污染水體和沉積環(huán)境的生物修復(fù)方面也發(fā)揮重要作用[6-11]。然而，SRB分布受環(huán)境因子如SO42-濃度、有機(jī)質(zhì)含量、溫度、溶解氧水平以及局部小生境微生物群落組成的影響[10-12]，因此，要探究硫酸鹽還原過程與湖泊水質(zhì)變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，有必要分析SRB的時(shí)空分布情況。本研究主要利用PCR擴(kuò)增和熒光原位雜交技術(shù)(Florescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)分析了阿哈湖沉積物中SRB的類群和數(shù)量的時(shí)空分布特征。

1材料與方法

1.1研究區(qū)和樣品采集

阿哈湖位于貴州省貴陽市西南郊，于1958年建壩，1960年蓄水，海拔1 108 m，流域匯水面積約190 km2，湖水面積約3.4 km2，平均水深為13 m，最大水深接近25 m，水輸送通量為1.04×108m3，湖水寄宿時(shí)間為0.44 a[1]。匯水區(qū)域分布有二疊系灰?guī)r及煤系地層，其上覆蓋有硅鋁質(zhì)和硅鐵質(zhì)黃壤，部分地區(qū)有三疊系碳酸鹽類巖石及泥頁巖出露，并發(fā)育有黑色、黃褐色石灰土[13]。湖泊周圍為疏林植被，灌草叢較多，流域年均降水量1 109 mm，年均氣溫15.3 ℃。

本次研究選擇阿哈湖大壩處(26°32′24.03″N，106°3851.94″E)沉積物為研究對(duì)象，是由于該處為各處水流交匯區(qū)域，具有煤礦廢水與生活污水復(fù)合污染的綜合特征。采用便攜式不擾動(dòng)湖泊沉積物采樣器[14]，于2013年5月和10月在阿哈湖大壩附近位置采集春季和秋季沉積物樣品(表1)。采集的沉積物柱有清晰的沉積物—水界面，沉積物未被擾動(dòng)。沉積物柱上部0.5 cm呈現(xiàn)棕黃色粗顆粒狀，代表水體的懸浮層，指示水體顆粒物的懸浮沉積過程，0.5 cm以下有約1.0 cm厚淺灰色的含不規(guī)則礦物結(jié)核的亞擴(kuò)散層，再往下至約11 cm深度是黑色沉積物摻雜一些棕褐色的斑點(diǎn)，12～21 cm為灰黃色沉積物，21 cm以下深度以黑色沉積物為主。沉積物柱在5～15 cm深度范圍有氣泡出現(xiàn)，反映了湖泊沉積環(huán)境早期成巖過程中的有機(jī)質(zhì)分解。沉積物柱芯現(xiàn)場(chǎng)在自制氮?dú)馐痔紫?持續(xù)通N2)中按1 cm間隔取樣，沉積物—水界面的水樣品也同步收集。

表1　阿哈湖采集的沉積物樣品的描述

1.2環(huán)境參數(shù)分析

沉積物—水界面的水樣品的溫度、pH值和溶解氧含量用便攜式水質(zhì)參數(shù)儀(WTW，pH3210/Cond 3210，德國)現(xiàn)場(chǎng)分析。

1.3SRB類群的PCR擴(kuò)增

1.3.1參考菌株

利用分子生物學(xué)方法對(duì)SRB 16SrDNA特異性序列進(jìn)行分析，可將SRB分為六大類群[15]：脫硫腸菌屬(類群1)(Desulfotomaculum，DFM)、脫硫葉菌屬(類群2)(Desulfobulbus，DBB)、脫硫桿菌屬(類群3)(Desulfobacterium，DBM)、脫硫細(xì)菌屬(類群4)(Desulfobacter，DSB)、脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬(類群5)(Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina，DCC-DNM -DSS)和脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬(類群6)(Desulfovibrio-Desulfomicrobium，DSV-DMB)。本研究中將以下菌株作為六大SRB類群的陽性控制菌株，分別為：DesulfotomaculumnigrificansNCIMB 8395(類群1)；DesulfobulbuspropionicusDSM 2032(類群2)；DesulfobacteriumautotrophicumDSM 3382(類群3)；DesulfobactercurvatusDSM 3379(類群4)；DesulfovibriodesulfuricansDSM 642(類群5)；DesulfosarcinavariabilisDSM 2060(類群6)。大腸桿菌EcoliATCC 8099作為陰性控制菌株[12]。

1.3.2DNA提取與純化

取0.1 g沉積物樣品溶解在500 μL 滅菌去離子水，于1.5 mL離心管中12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 000 L STE (0.1 M NaCl，10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA)。隨后沉積物DNA用Fast DNA SPIN kit (Bio101)試劑盒提取和純化，用同樣的方法提取參考菌株的DNA。提取出來的DNA樣本進(jìn)行含量和純度分析。將DNA標(biāo)本用TE稀釋100倍，以TE緩沖液作為空白調(diào)零，利用紫外—可見分光光度儀測(cè)定樣本的OD260和OD280。根據(jù)1 OD260相當(dāng)于50 ng/μL DNA計(jì)算出各個(gè)樣品DNA含量，并將其稀釋至50 ng/μL。同時(shí)計(jì)算出OD260/OD280，比值介入1.8-2.0為合格。

1.3.3PCR擴(kuò)增

DNA純化后，用針對(duì)六大SRB類群特異性16S rDNA 序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。采用PCR熱啟動(dòng)程序，共包含30個(gè)循環(huán)(表2)。每個(gè)PCR管(50 μL)包含5 μL 10 × PCR 緩沖液，5 μL MgCl2(25 mM)，上下游引物各2 μL(10 pmol/μL)，4 μL dNTP (2.5 mM)，2 μL Taq 聚合酶 (1 U/μL)，4 μL DNA 模板(50 ng/μL)和 26 μL 滅菌去離子水。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5 %(w / v)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀中分析并拍照。通過與DNA 標(biāo)志物比對(duì)，以待測(cè)樣品和陽性對(duì)照有特異性目的條帶出現(xiàn)，而陰性對(duì)照無特異性目的條帶出現(xiàn)，判斷為待測(cè)樣品中有該類群SRB存在。

表2　六大SRB類群的PCR循環(huán)條件

1.4熒光原位雜交技術(shù)分析SRB數(shù)量

1.4.1寡核苷酸探針

檢測(cè)SRB的通用探針為SRB385(序列為：5’ CGG CGT CGC TGC GTC AGG 3’)[16]，陰性對(duì)照探針為NON338(序列為：5’ ACT CCT ACG GGA GGC AGC 3’)[17]，同一樣品雜交細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果由SRB385探針計(jì)數(shù)的信號(hào)減去NON338探針計(jì)數(shù)的信號(hào)為最終結(jié)果。上述探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用5’端Cy3標(biāo)記。

1.4.2參考菌株

陽性控制菌株為DesulfobulbuspropionicusDSM 2032，陰性控制菌株為EColiATCC 8099。

1.4.3樣品預(yù)處理與固定

取0.1 g新鮮沉積物樣品加入適量PBS(0.13 M NaCl，7 mM Na2HPO4，3 mM NaH2PO4，pH 7.2)中，漩渦震蕩混勻，10 000 rpm離心10 min，棄上清，重復(fù)3次；隨后加入適量PBS(pH7.2)稀釋。樣品混勻后，取0.1 g均勻涂布于多聚賴氨酸包被的玻片上，空氣干燥30 min；在4 %多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中室溫固定20 min，PBS(pH7.2)洗滌5 min，Milli-Q超純水洗滌5 min，空氣干燥；濕盒中用2 mg/ml溶菌酶32 ℃處理10 min，PBS(pH7.2)洗滌5 min，Milli-Q超純水洗滌5 min，空氣干燥；分別用50 %、80 %和96 %乙醇固定3 min，空氣干燥。

1.4.4熒光原位雜交反應(yīng)與鏡檢

取27 μL 熒光原位雜交緩沖液(0.9 M NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA，0.01 % SDS，25 %甲酰胺，pH 7.2)和3 μL探針(25 ng /μL)混勻，并點(diǎn)到樣品上，濕盒中46 ℃雜交2 h；洗滌緩沖液(54 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，0.01 % SDS，5 mM EDTA，pH 7.2)50 ℃洗滌30 min，Milli-Q超純水中漂洗，空氣干燥，封片。用Nikon Eclipse 80i 落射熒光顯微鏡進(jìn)行SRB鏡檢，計(jì)數(shù)發(fā)紅色熒光的菌體為SRB。采用Nikon NIS Elements AR熒光成像分析軟件進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

1.4.5自發(fā)熒光

沉積物中有大量的自發(fā)熒光物質(zhì)，波長(zhǎng)主要在520～580 nm，自發(fā)熒光物質(zhì)可能是纖維性或顆粒狀物，在光鏡下無原核生物的菌體形態(tài)[18]。觀察時(shí)如果懷疑為自發(fā)熒光物質(zhì)，可以根據(jù)熒光的顏色和普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)一步觀察發(fā)光物的形態(tài)來進(jìn)行鑒別，以減少特異性熒光檢測(cè)的干擾。

2結(jié)果與討論

2.1SRB類群的時(shí)空分布

從沉積物樣品中擴(kuò)增出四個(gè)SRB類群(圖1和表3)，即脫硫腸菌屬、脫硫葉菌屬、脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬和脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬。脫硫桿菌屬和脫硫細(xì)菌屬?zèng)]有檢出。不同的SRB類群有不同的時(shí)空分布。脫硫腸菌屬主要分布在沉積物中部，脫硫葉菌屬主要分布在上層和中層沉積物中，脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬在春季沉積物樣品中主要分布在上層，在秋季沉積物樣品中主要分布在上層和下層。脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬在秋季沉積物樣品中分布廣泛。

表3　SRB類群在阿哈湖春季和秋季

注：DFM代表脫硫腸菌屬；DBB代表脫硫葉菌屬；DBM代表脫硫桿菌屬；DSB代表脫硫細(xì)菌屬；DCC-DNM-DSS代表脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬；DSV-DMB代表脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬。

圖1阿哈湖秋季沉積物樣品中脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬的PCR擴(kuò)增代表圖(目的條帶為610 bp，M為DNA標(biāo)志物，0-13代表沉積物深度(cm)，N代表陰性控制，P代表陽性控制)Fig.1Representative PCR amplifications of Desulfovibrio-Desulfomicrobium in Autumn sediment of Lake Aha (Targed band：610 bp，M：DNA Ladder；Lanes 0-13 correspond to sediment depths；N，negative control；P，positive control)

阿哈湖沉積物中檢測(cè)的SRB類群不同與具有相似地質(zhì)和氣候特征的貴州紅楓湖沉積物中SRB類群的檢測(cè)結(jié)果[19]。紅楓湖沉積物中檢測(cè)出脫硫桿菌屬、脫硫細(xì)菌屬、脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬和脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬。阿哈湖沉積物中SRB類群主要分布在230 mm以上深度，而紅楓湖沉積物中SRB類群主要分布在70 mm以上深度，指示阿哈湖沉積物中SRB具有更大的活性。阿哈湖和紅楓湖沉積物中SRB不同的類群分布可能與兩個(gè)湖泊不同的環(huán)境條件有關(guān)(如阿哈湖酸礦廢水的輸入)。

從季節(jié)對(duì)比來看，春季沉積物中SRB類群主要分布在230 mm以上，秋季沉積物中SRB類群主要分布在250 mm以上。每一個(gè)檢測(cè)出來的SRB類群都主要分布在沉積物柱芯的上層，同時(shí)，不同的SRB類群具有不同的時(shí)間和深度分布特征。一些SRB類群在一定的季節(jié)和深度范圍內(nèi)占優(yōu)勢(shì)，如脫硫腸菌屬和脫硫葉菌屬在春秋季沉積物中分布在上層和下層沉積物中，脫硫球菌屬—脫硫線菌屬—脫硫八疊菌屬春季時(shí)分布在上層沉積物中，在秋季時(shí)分布在上層和下層沉積物中。脫硫弧菌屬-脫硫微菌屬在秋季沉積物中具有廣泛的分布范圍?？傮w來看，每個(gè)SRB類群在秋季的分布范圍要大于在春季的分布范圍，這指示秋季沉積物的環(huán)境條件更適于SRB類群的存活。

研究表明，自然生境中少于1 %的總的原核生物數(shù)量能夠獲得純培養(yǎng)，一個(gè)重要的原因是自然生境中很多微生物可以隨著環(huán)境條件的變化而處于不可育狀態(tài)[20]，處于該狀態(tài)的微生物通常無繁殖活性，DNA含量非常低，類似醫(yī)學(xué)微生物的“可見不可育狀態(tài)”，其機(jī)理還不清楚。據(jù)此分析，洱海秋季沉積物樣品中檢測(cè)到了脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬，而春季沉積物樣品中沒有檢出這個(gè)類群，指示脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬在春季的沉積環(huán)境中可能處于不可育狀態(tài)，活性低以致無法檢測(cè)出來。許多研究表明多數(shù)SRB是嚴(yán)格厭氧和嗜溫的，包括脫硫弧菌屬菌株[12]。從表4可以看出，相比秋季，春季沉積物—水界面溶解氧含量高而溫度低，這可能導(dǎo)致脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬在春季沉積環(huán)境中為不可育狀態(tài)而無法檢測(cè)[12]。

表4　阿哈湖沉積物—水界面水溫度、pH值和溶解氧含量

2.2熒光原位雜交檢測(cè)的 SRB數(shù)量

熒光原位雜交(Florescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)是一種免培養(yǎng)的檢測(cè)具有特定環(huán)境功能細(xì)菌的技術(shù)，被廣泛用于分析自然生境中的SRB數(shù)量[21-22]。本研究沉積物樣品中與SRB385探針雜交的細(xì)胞可見明顯的熒光信號(hào)，指示樣品中豐富的rRNA含量。陽性控制菌株可見明顯的熒光信號(hào)，而陰性控制菌株與SRB385探針不發(fā)生反應(yīng)而沒有熒光信號(hào)(圖2)。

(a.陽性控制菌株；b.陰性控制菌株； c.沉積物樣品)

在春季采集的沉積物樣品中，SRB主要分布在0～240 mm，250～280 mm接近不可檢測(cè)(圖3)。SRB數(shù)量從不可檢測(cè)到34.39×104cells/g濕沉積物范圍之內(nèi)變化，最高值出現(xiàn)在80 mm深度。在秋季采集的沉積物樣品中，SRB主要分布在0～250 mm，260～290 mm未檢測(cè)到SRB。SRB數(shù)量從不可檢測(cè)到26.23×104cells/g濕沉積物范圍之內(nèi)變化，最高值出現(xiàn)在90 mm深度。綜合來看，SRB數(shù)量從沉積物表層向下逐漸增加，在80 mm深度(春季)和90 mm深度(秋季)達(dá)到最大值，之后隨沉積深度加深SRB數(shù)量逐漸減小。表層沉積物SRB數(shù)量低可能與表層沉積物存在較低濃度的溶解氧，這不利于厭氧的SRB生存有關(guān)，深層沉積物SRB數(shù)量的減小可能與較低的有機(jī)碳和SO42-含量有關(guān)[10-12]。在沉積物柱芯50～150 mm深度范圍觀測(cè)到氣泡出現(xiàn)，這指示有機(jī)質(zhì)分解主要發(fā)生在150 mm以上的深度范圍。

圖3　阿哈湖沉積物中SRB數(shù)量的時(shí)空分布

總體來看，阿哈湖秋季沉積物中SRB類群與數(shù)量高于春季沉積物中SRB類群和數(shù)量，這可能與湖泊沉積物—水界面環(huán)境參數(shù)(如溫度、溶解氧)的季節(jié)性差異有關(guān)[23-24]。如表4所示，相比春季，秋季沉積物—水界面一些環(huán)境參數(shù)(較高的溫度和較低的溶解氧含量)更適于SRB生長(zhǎng)和繁育。另外，SRB數(shù)量的最大峰值出現(xiàn)在不同深度，并且，春季沉積物80 mm深度的SRB數(shù)量高于秋季沉積物90 mm深度的SRB數(shù)量，這指示影響沉積物中SRB群落變化的因素是復(fù)雜的。

3結(jié)論

利用PCR擴(kuò)增和FISH技術(shù)對(duì)阿哈湖沉積物中SRB類群和數(shù)量的分析顯示，SRB類群和數(shù)量分布具有明顯的季節(jié)和垂直深度的變化，這種時(shí)空分布的差異可能與一些環(huán)境因子(如SO42-含量、有機(jī)碳源類型及其可利用性、溶解氧水平、溫度等)的季節(jié)和深度變化有關(guān)?？傮w來看，阿哈湖秋季沉積物SRB類群和數(shù)量均多于春季沉積物樣品，指示秋季沉積環(huán)境更適于SRB存活。另外，春季沉積環(huán)境溶解氧含量較高，且溫度較低，這可能導(dǎo)致脫硫弧菌屬—脫硫微菌屬在春季沉積物中處于不可育狀態(tài)，由于其活性低而無法檢測(cè)。

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The vertical and temporal distributions of sulfate-reducing bacteria in sediments of Lake Aha

ZHANG Wei1，2

(1SchoolofGeographyandTourism，GuizhouNormalCollege，Guiyang550018，China；2StateKeyLaboratoryofEnvironmentalGeochemistry，InstituteofGeochemistry，ChineseAcademyofSciences，Guiyang550002，China)

Abstract：The distribution of sulfate-reducing bacteria (SRB) in the sediments of Lake Aha was analyzed based on evaluation of the presence and quantity of six main groups of SRB in sediments collected during spring and autumn.The results show that four SRB groups (Desulfotomaculum，Desulfobulbus，Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina and Desulfovibrio- Desulfomicrobium) are present in autumn，while only three groups (Desulfotomaculum，Desulfobulbus and Desulfococcus- Desulfonema-Desulfosarcina) are detected in spring.Compared with the autumn of Lake Aha，sediments in spring have relatively high dissolved oxygen contents and low temperature，which may lead to the inactive status of Desulfovibrio-Desulfomicrobium in the sediments and then the Desulfovibrio-Desulfomicrobium is undetectable due to its low activity.The distribution of each SRB group is wider in sediments collected in autumn than in spring，and they show a greater overall presence and quantity in autumn than in spring.These findings indicate that the environmental conditions in autumn are more suitable for SRBs.

Keywords：sulfate-reducing bacteria；vertical and temporal distribution；PCR；FISH；lake Aha

作者簡(jiǎn)介：張偉(1980-)，男，博士，副教授。主要研究方向：為環(huán)境與生物地球化學(xué)，已發(fā)表中英文論文20余篇。

*基金項(xiàng)目：貴州省自然科學(xué)基金(黔科合J字[2014]2135)，中國博士后基金面上項(xiàng)目(2015M572503)和貴州師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目(13BS023)聯(lián)合資助。

收稿日期：2015-11-30；修回日期：2015-12-02

中圖分類號(hào)：Q 178；P 272

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-6563(2016)01-0057-07