抗血管性血友病因子抗體對特發(fā)性血栓性血小板減少性紫癜的影響

覃乃輝，裴正玲，周達利，秦 立，黃慧嬪

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)南寧市第一人民醫(yī)院檢驗科 530022）

血栓性血小板減少性紫癜（TTP）是一種罕見的血栓性疾病，其特點是播散性微血管血栓形成導致的血小板減少和微血管性溶血性貧血［1］，并可引起患者多器官功能障礙而嚴重危及患者的生命。TTP是臨床的罕見病，臨床上通常根據(jù)發(fā)病機制分為遺傳性、繼發(fā)性和特發(fā)性3種類型，其中，特發(fā)性TTP是臨床上最常見的類型［2－3］。有研究發(fā)現(xiàn)，TTP患者血漿中存在超大分子量的血管性血友病因子（vWF）多聚體，在發(fā)病過程中起到至關重要的作用［4］。而以往研究表明，大多數(shù)特發(fā)性TTP患者vWF多聚體的形成是由于患者血漿中存在抗血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）自身抗體［5－6］。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)部分特發(fā)性TTP患者存在抗血管性血友病因子（vWF）抗體，可能在發(fā)病中起到重要的作用［7］。為探討vWF抗體在特發(fā)性TTP發(fā)病中的意義，作者進行了相關研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院2010年1月至2013年6月收治的特發(fā)性TTP患者28例，平均（24.8±7.8）歲；另選同期門診體檢的健康者30例作為健康對照組，平均（25.6±7.2）歲，所有參與研究的人員均對研究知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法 所有受試者采集外周靜脈血5mL，注入枸櫞酸鈉抗凝，3000r／min離心10min，分離血漿，置于－70℃低溫保存集中檢測。應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測受試者血漿ADAMTS13抗原水平，由廣西醫(yī)科大學腫瘤學重點實驗室檢測，具體方法：應用抗ADAMTS13單克隆抗體2G3（4μg／mL）（試劑盒購自丹麥Dako公司）包被96孔板，4℃過夜，采集50μL患者血漿按1∶4，1∶8，1∶16稀釋，加入待測孔，37℃孵育1h，滴加ADAMTS13單克隆抗體作為一抗，室溫孵育1h，加入生物學二抗，辣根過氧化酶GAMHRP（Sigma公司生產(chǎn)）標記，室溫孵育1h，應用鄰苯二胺顯色，1.5mol／L硫酸終止反應，490nm酶標儀讀取吸光度值。如待檢混合血漿中ADAMTS13活性較正常血漿的混合血漿ADAMTS13活性下降50%以上，表示待檢血漿中存在抑制物。vWF抗體檢測采用ELISA法（試劑盒購自丹麥Dako公司），酶標儀讀取490nm條件下反應物吸光度A值，如檢測值高于x±2s則判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TTP患者vWF抗體檢測結(jié)果 28例特發(fā)性TTP患者中有3例患者vWF抗體陽性（vWF抗體陽性組），其余患者vWF抗體陰性（vWF抗體陰性組）。vWF抗體陽性組ADAMTS13抗體均為陰性，ADAMTS13含量均低于正常值，見表1。

表1 3例vWF抗體陽性TTP患者檢測結(jié)果

2.2 3組ADAMTS13抗原和vWF抗體檢測情況 將所有受試者檢測結(jié)果分析，vWF抗體陽性組（3例，4份血漿）血漿ADAMTS13含量為（73.88±35.52）mU／mL，vWF抗體陰性組（25例，32份血漿）血漿 ADAMTS13含量為（102.71±38.66）mU／mL，健康對照組（30例，30份血漿）血漿 ADAMTS13含量為（528.78±185.66）mU／mL，vWF抗體陽性組血漿ADAMTS13含量明顯低于vWF抗體陰性組和健康對照組，3組血漿ADAMTS13含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。vWF抗體陽性組患者血漿vWF抗體A值明顯高于vWF抗體陰性組和健康對照組（P＜0.01），見表2。

2.3 28例特發(fā)性TTP血漿置換（PE）前后血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體水平檢測 28例患者中23例采取PE治療，其中，17例經(jīng)過2次PE治療，6例經(jīng)過1次PE治療，PE治療后血漿ADAMTS13抗原明顯升高，vWF抗體A值明顯降低（P＜0.05），見表3。

表2 3組血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體檢測情況

表3 28例特發(fā)性TTP PE前后ACMTS13抗原和vWF抗體水平

3 討 論

TTP是一種罕見的血栓性疾病，多年以來，臨床上診斷TTP主要依賴于“五聯(lián)征”和溶血、血栓等實驗指標，給其診斷和治療帶來了一定的困難［8］。直到1998年，F(xiàn)urlan等［9］研究發(fā)現(xiàn)TTP患者血漿中ADAMTS13活性嚴重缺乏，給TTP發(fā)病機制的研究帶來了新的方向。研究證實，TTP患者血漿ADAMTS13缺乏主要是由于患者ADAMTS13基因突變或抗ADAMTS13自身抗體引起［10］。目前，血漿ADAMTS13缺乏在TTP發(fā)病中的作用已經(jīng)得到廣大學者的認同［11］。有報道表明，特發(fā)性TTP患者中血漿ADAMTS13活性嚴重缺乏的發(fā)生率為33%～100%，平均為75%［12］。然而，仍有1／4的TTP患者血漿ADAMTS13活性正?；騼H輕度降低，而4%～62%的特發(fā)性TTP患者也未發(fā)現(xiàn)抗ADAMTS13自身抗體［13］。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，TTP患者血漿中存在超大分子量的vWF多聚體，在發(fā)病過程中起到至關重要的作用［14］。而部分特發(fā)性TTP患者存在vWF抗體，可能在發(fā)病中起到重要的作用。Bonnefoy等［15］認為，TTP患者vWF抗體與vWF形成復合物，是誘導患者血小板自發(fā)性聚集的原因之一。本研究對28例特發(fā)性TTP患者血漿ADAMTS13和vWF相關指標進行了檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3例TTP患者vWF抗體陽性。這3例患者血漿中均存在vWF多聚體，但抗ADAMTS13為陰性。vWF Ag、vWF CB和vWF Rcof均正常，基本可以排除獲得性血管性血友病。進一步分析發(fā)現(xiàn)，vWF抗體陽性組、vWF抗體陰性組血漿ADAMTS13含量均明顯低于健康對照組，證實了TTP患者血漿ADAMTS13活性嚴重缺乏。而vWF抗體陽性組血漿ADAMTS13含量明顯低于vWF抗體陰性組，提示vWF抗體可能對抗ADAMTS13活性，并參與vWF復合物的形成，在特發(fā)性TTP發(fā)病中起到重要的作用。

為進一步證實以上觀點，作者對28例患者PE前后血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體水平進行了比較。從結(jié)果來看28例特發(fā)性TTP經(jīng)過PE后ADAMTS13抗原明顯升高，vWF抗體A值明顯降低。目前，PE仍是TTP急性發(fā)作的主要治療方法，該方法可以顯著降低患者的病死率，延長患者生存時間。本實驗結(jié)果提示，通過PE治療后患者vWF抗體水平明顯降低，而血漿ADAMTS13含量得到提高，并可能進一步影響vWF復合物的形成，使疾病得到緩解。

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