血漿檢測(cè)microRNA－125a－3p、IGF－2在監(jiān)測(cè)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的價(jià)值＊

張洪川，徐艷梅，周 璞，孫建國，陳正堂

（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

在世界范圍內(nèi)，肺癌為惡性腫瘤死亡的首要原因，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%［1］。肺癌的病死率高主要原因是診斷時(shí)大部分肺癌已經(jīng)是晚期［2］，臨床診斷的時(shí)候，高達(dá)75%的肺癌已經(jīng)局部晚期和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是晚期NSCLC治療失敗最常見的原因之一，大部分患者是死于轉(zhuǎn)移灶引起的相關(guān)并發(fā)癥。因此，找到一種簡便、可靠的方法去監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移是非常重要的。microRNA（miRNA）的發(fā)現(xiàn)打開了分子標(biāo)志物的一個(gè)新領(lǐng)域。2008年首次發(fā)現(xiàn)外周血中富含大量的穩(wěn)定miRNA，這使在血漿中尋找腫瘤生物信號(hào)成為可能。miRNA可以以一個(gè)被保護(hù)的狀態(tài)存在于血漿中，因此可以直接從血漿中檢測(cè)到。Roth等［4］研究報(bào)道，肺癌患者血漿microRNA－141（miR－141）和 miR－155明顯高于良性患者，高水平miR－10b預(yù)示著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)顯示，某些血漿miRNA能夠預(yù)測(cè)肺癌的發(fā)展和預(yù)后。已有報(bào)道血尿中miR－125a－3p在健康人與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、乳腺癌等之間存在差異表達(dá)，然而在肺癌患者外周血中的表達(dá)情況還不清楚。用3種常用的生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)miR－125a－3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子2（insulin－like growthfactors 2，IGF2）在3種軟件中都能夠被預(yù)測(cè)到，而且，miR－125a－3p在IGF2的3′非編碼區(qū)（3′UTRs）有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此，IGF2 可能為miR－125a－3p的靶基因［5］。IGF2是一種重要的促胚胎細(xì)胞生長因子，也是一種促有絲分裂肽，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、胚胎形成、產(chǎn)后生長發(fā)育等作用，生理?xiàng)l件下對(duì)胚胎的正常生長發(fā)育有重要作用，病理?xiàng)l件下能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。目前，IGF2被認(rèn)為是多種腫瘤重要的自分泌生長因子，其過度表達(dá)已被證實(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用［6］。本研究主要檢測(cè)血漿中 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)水平，探討其在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的價(jià)值，研究二者表達(dá)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集93例血漿標(biāo)本其中20例健康成人（健康對(duì)照組），男12例，女8例；年齡27～75歲，中位年齡59歲。73例NSCLC患者，均為初診患者，經(jīng)病理科診斷為NSCLC后入組，根據(jù)影像學(xué)資料進(jìn)行TNM分期。Ⅰ／Ⅱ期組33例，男18例，女15例；年齡36～78歲，中位年齡62歲；鱗癌15例，腺癌18例；其中，Ⅰ期19例，Ⅱ期14例。Ⅲ／Ⅳ期組40例，男21例，女19例；年齡37～82歲，中位年齡60歲；鱗癌14例，腺癌26例；其中，Ⅲ期13例，Ⅳ期27例。分期根據(jù)腫瘤分期系統(tǒng)（2009）。所有的血液標(biāo)本采用5mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集，均在患者做手術(shù)和治療前收集。在2h內(nèi)將收集的血液標(biāo)本在4℃離心機(jī)中3000r／min離心15min。收集上清液立即儲(chǔ)存于－80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在http：∥www.mirbase.org網(wǎng)站查找人－miR－125a－3p、線蟲－miR－39序列并設(shè)計(jì)引物，引物合成由廣州銳博生物科技有限公司完成。

1.2.2 總RNA的提取 應(yīng)用Ambion mirVana PARIS試劑盒（Foster City，CA）提取600μL血漿樣品中的總RNA，首先加入600μL的10%十二烷基硫酸鈉（SDS）混勻在4℃條件下孵育1h對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理，為了控制樣本間提取效率的差異，在樣品加入變性液后加入25fmol人工合成的cel－miR－39進(jìn)行校正。隨后的總RNA提取步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。最后用30μL無酶水洗脫離心柱得到總RNA。應(yīng)用分光光度計(jì)對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 cDNA合成 取10μL總RNA使用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real time試劑盒（RR037A）進(jìn)行cDNA的合成。20μL反應(yīng)體系如下：10.0μL總RNA，5×PrimeScript Buffer（for real time）4.0μL，人－miR－125a－3PRT－prime 0.5 μL，線蟲－miR－39RT－prime 0.5μL，無 RNA酶水4.0μL，PrimeScript Enzyme MixⅠ1μL。反應(yīng)條件為：42℃15min，85℃5s，之后保存于4℃。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量－PCR（qRT－PCR）反應(yīng) 采用 Applied Biosystems（ABI7500高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)），按照用戶手冊(cè)進(jìn)行操作。采用20μL的反應(yīng)體系，具體操作參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ的使用說明。最終確定的反應(yīng)體系為20μL，包括cDNA 合成步驟的產(chǎn)物2.0μL，SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，正向、反向引物各0.8μL（10μmol／L），無RNA酶水6μL。反應(yīng)過程具體為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火及延伸34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；結(jié)束后通過95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲線。每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔，冰上避光操作。反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)得出熔解曲線。各個(gè)組之間的 miR－125a－3p表達(dá)量用2－△△Ct表示。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 優(yōu)爾生公司SEA051Hu 96T測(cè)定血漿IGF－2水平，嚴(yán)格按操作說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于miRNA的準(zhǔn)確定量是必不可少的，評(píng)估所有的miR－125a－3p的表達(dá)通過線蟲 miR－39來標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用2－△△Ct方法。根據(jù)Q－Q圖、偏峰度計(jì)算推斷數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均采用非參數(shù)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（25%百分位數(shù)至75%百分位數(shù)）表示。miR－125a－3p、IGF－2在2個(gè)獨(dú)立樣本組間表達(dá)差異使用 Mann－Whitney U 檢驗(yàn)，在3個(gè)獨(dú)立樣本組間使用Kruskall－Wallis檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析法分析 miR－125a－3p與IGF－2的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

從20例健康對(duì)照組、33例Ⅰ／Ⅱ期、40例Ⅲ／Ⅳ期NSCLC患者血漿中檢測(cè)了 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)中得到的溶解曲線（圖1）表明qRT－PCR產(chǎn)物均具有特異性。

圖1 部分樣本的溶解曲線

表1 血漿miR－125a－3p水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

表2 血漿IGF－2水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 血漿IGF－2水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.1 血漿 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)與 NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC血漿miR－125a－3p的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、病理類型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NSCLC血漿IGF－2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、病理類型、臨床分期無關(guān)（P＞0.05），見表1、2。

2.2 比較健康對(duì)照組、Ⅰ／Ⅱ期患者、Ⅲ／Ⅳ期患者血漿中miR－125a－3p水平 Kruskall－Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組存在差異（χ2＝13.449，P＝0.001），見圖2。進(jìn)一步比較兩兩之間的差異，發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組1.276（0.742～2.396）ng／mL較Ⅰ／Ⅱ期組1.231（0.756～1.957）ng／mL表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.776）。Ⅲ／Ⅳ期組0.666（0.407～1.098）ng／mL較健康對(duì)照組1.276（0.742～2.396）ng／mL低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.005）。Ⅲ／Ⅳ期組0.666（0.407～1.098）ng／mL較Ⅰ／Ⅱ期患者組1.231（0.756～1.957）ng／mL低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001）。

圖2 miR－125a－3p的表對(duì)表達(dá)水平

2.3 比較血漿中IGF－2水平在健康對(duì)照組、Ⅰ／Ⅱ期組、Ⅳ期組之間的差異 Kruskall－Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組間存在差異（χ2＝7.147，P＝0.028）。進(jìn)一步比較兩兩之間的差異，Ⅰ／Ⅱ期組IGF－2水平969.680（837.558～1066.264）ng／mL、Ⅲ／Ⅳ期組1014.501（813.720～1172.469）ng／mL較健康對(duì)照組779.191（696.856～906.369）ng／mL高（P＝0.036、P＝0.011）。Ⅰ／Ⅱ期組與Ⅲ／Ⅳ期組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.451）。

2.4 血漿 miR－125a－3p與IGF－2相關(guān)性分析 血漿中 miR－125a－3p表達(dá)與IGF－2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.280，P＝0.007）。

3 討 論

miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。原發(fā)腫瘤通過播散侵襲進(jìn)入周圍組織，以及轉(zhuǎn)移灶的生長都需要一系列協(xié)調(diào)事件，包括原發(fā)腫瘤灶腫瘤細(xì)胞的分裂，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)和遠(yuǎn)處病灶細(xì)胞的增殖。侵襲轉(zhuǎn)移需要的一系列步驟涉及許多基因表達(dá)的改變［7］。關(guān)于miRNA已有研究證實(shí)有幾個(gè)miRNA具有促進(jìn)或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。如miRNA－183可以抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子［8］。miR－221、miR－222通過活化AKT通路促進(jìn)細(xì)胞的遷移［9］。目前，對(duì) miR－125a的研究主要集中在 miR－125a－5p，大量的研究表明miR－125a－5p在肺癌中低表達(dá)，并且可抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，現(xiàn)有報(bào)道表明mir－125a的另一成熟體miR－125a－3p在腫瘤中的作用也不容忽視［10］。已有研究證實(shí) miR－125a－5p、miR－125a－3p都與 NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR－125a－3p的表達(dá)與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，miR－125a－3p在分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織越低。在肺癌細(xì)胞株中的體外研究揭示 miR－125a－3p可抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［8］。miR－125a－3p在胃癌組織比正常組織表達(dá)低，與轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。有淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織較沒有轉(zhuǎn)移的胃癌組織miR－125a－3p表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體外研究證實(shí)miR－125a－3p具有抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用［10］。最近的報(bào)道顯示，miR－125－3p通過靶向Fyn減少細(xì)胞擴(kuò)增和遷移。miR－125a－3p過表達(dá)降低了FAK、paxillin和Akt的活性，阻斷了細(xì)胞周期，破壞了細(xì)胞的生存和遷移能力［11］。miR－125a－3p在高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981中的表達(dá)水平明顯低于在低轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NL9980，提示miR－125a－3p可能具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［12］?？傊?，越來越多的證據(jù)表明miR－125a－3p具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

本文對(duì)miR－125a－3p及其潛在的靶基因產(chǎn)物IGF－2的表達(dá)進(jìn)行探索。miR－125a－3p在NSCLC外周血中的表達(dá)健康對(duì)照組與Ⅰ／Ⅱ期組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明miR－125a－3p不能作為NSCLC的早期篩查指標(biāo)；但在TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與miR－125a－3p的功能相關(guān)，miR－125a－3p主要抑制細(xì)胞的遷移能力，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，過表達(dá)miR－125a－3p可以抑制細(xì)胞的侵襲遷移能力，低表達(dá)的miR－125a－3p可能作為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在標(biāo)志物。有研究已證實(shí)IGF－2高表達(dá)與前列腺癌、直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IGF－2在NSCLC組織中高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［13］。血清IGF－2在NSCLC及小細(xì)胞肺癌中較健康對(duì)照組高表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)IGF－2在NSCLC患者血漿中高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)。miR－125a－3p可能負(fù)調(diào)控IGF－2的表達(dá)，具體機(jī)制還不明確，本研究發(fā)現(xiàn)了這一相關(guān)性，需后期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)去進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Li Y，Jiang Q，Xia N，et al.Decreased expression of microRNA－375in nonsmall cell lung cancer and its clinical significance［J］.J Int Med Res，2012，40（5）：1662－1669.

［2］Lin Q，Mao W，Shu Y，et al.A cluster of specified microRNAs in peripheral blood as biomarkers for metastatic non－small－cell lung cancer by stem－loop RT－PCR［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（1）：85－93.

［3］Ulivi P，F(xiàn)oschi G，Mengozzi M，et al.Peripheral blood miR－328expression as a potential biomarker for the early diagnosis of NSCLC［J］.Int J Mol Sci，2013，14（5）：10332－10342.

［4］Roth C，Kasimir－Bauer S，Pantel K，et al.Screening for circulating nucleic acids and caspase activity in the peripheral blood as potential diagnostic tools in lung cancer［J］.Mol Oncol，2011，5（3）：281－291.

［5］Jiang LL，Huang Q，Zhang SY，et al.Hsa－miR－125a－3p and hsa－miR－125a－5p are downregulated in non－small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells［J］.BMC Cancer，2010，10（1）：1－13.

［6］楊季紅，程樹杰.IGF－2和H19與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，2011，18（18）：2836－2839.

［7］Du L，Pertsemlidis A.microRNAs and lung cancer：tumors and 22－mers［J］.Cancer Metastasis Rev，2010，29（1）：109－122.

［8］Wang G，Mao W，Zheng S.MicroRNA－183regulates Ezrin expression in lung Cancer cells［J］.FEBS Lett，2008，582（25／26）：3663－3668.

［9］Garofalo M，Di Leva G，Romano G，et al.miR－221＆222 regulate TRAIL resistance and enhance tumorigenicity through PTEN and TIMP3downregulation［J］.Cancer Cell，2009，16（6）：498－509.

［10］Hashiguchi Y，Nishida N，Mimori K，et al.Down－regulation of miR－125a－3p in human gastric Cancer and its clinicopathological significance［J］.Int J Oncol，2012，40（5）：1477－1482.

［11］Ninio－Many L，Grossman H，Shomron N，et al.microRNA－125a－3p reduces cell proliferation and migration by targeting Fyn［J］.J Cell Sci，2013，126（Pt 13）：2867－2876.

［12］魯為山，李書軍，周清華.不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNAs的篩選研究［J］.中國肺癌雜志，2011，11（14）：835－837.

［13］廖永德，趙金平，周晟，等.IGF1和IGF2表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性［J］.腫瘤防治研究，2006，33（12）：868－871.

［14］Izycki T，Chyczewska E，Naumnik W，et al.Serum levels of IGF－I and IGF－II in patients with lung Cancer during chemotherapy［J］.Exp Oncol，2004，26（4）：316－319.