血漿游離脂肪酸組成與非酒精性脂肪性肝病的相關(guān)性研究＊

冉 莉，萬 婧，張海英，陳詩慧，高燕翔，張乾勇，糜漫天

（第三軍醫(yī)大學(xué)營養(yǎng)與食品安全研究中心／重慶市營養(yǎng)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，其隨病情的發(fā)展表現(xiàn)為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌［1－2］。隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的變化和生活方式的改變，NAFLD患病率和診斷率日益增高，國外報(bào)告發(fā)病率接近20%～30%［3］。近20年來亞洲國家NAFLD增長迅速且呈低齡化發(fā)病趨勢，中國的上海、廣州和香港等發(fā)達(dá)地區(qū)成人NAFLD患病率在15%左右［4］。NAFLD與膳食、營養(yǎng)因素，尤其與膳食脂肪酸密切相關(guān)，血漿游離脂肪酸組成能夠準(zhǔn)確地反映近數(shù)周的膳食脂肪攝入情況，可以較真實(shí)地反映個(gè)體脂肪酸暴露水平。本研究分析了重慶市NAFLD患者和健康對(duì)照人群血漿游離脂肪酸的組成，旨在探討NAFLD與脂肪酸攝入的相關(guān)性，為NAFLD的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年5～12月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院體檢中心診斷的105例NAFLD患者作為病例，同時(shí)按照年齡、性別、居住地等信息配比選擇相應(yīng)的健康對(duì)象110名作為對(duì)照。NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年修訂版中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)脂肪肝和酒精性脂肪肝病學(xué)組“非酒精性脂肪性肝病診療指南”［5］，空腹B超提示脂肪肝，同時(shí)要求無飲酒史或飲酒折合乙醇量小于每周140g（女性每周小于70g），并排除病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒆陨砻庖咝愿尾〉瓤蓪?dǎo)致脂肪肝的特定疾病。

1.2 試劑與儀器 37種甲酯化脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和正己烷（GC）購于Sigma公司。14%三氟化硼（GC）購于上海安普公司。6890N氣相色譜儀為美國Agilent公司，配置氫離子火焰檢測器，DB－23石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。低溫離心機(jī)為美國Sigma公司，低溫冰箱為美國FORMA公司，漩渦混合器（國產(chǎn)），氮?dú)獯蹈蓛x（國產(chǎn)）。

1.3 方法 所有試驗(yàn)對(duì)象空腹采集外周靜脈血約5mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3000r／min離心10min，分離血漿，于－80℃冰箱保存。用一步甲酯化反應(yīng)法［6］進(jìn)行血漿樣品的預(yù)處理：在螺口玻璃試管中分別加入1.5mL正己烷和1.5mL 14%三氟化硼，加入100L血漿樣品，旋緊蓋子，100℃水浴60 min，冷卻至室溫，加入1mL蒸餾水，漩渦振蕩30s，3000 r／min離心10min，吸取上層液，氮?dú)獯蹈桑?00μL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)存管中并充氮?dú)夥馍w保存待測。用氣相色譜儀分析血漿游離脂肪酸水平，將血漿樣品色譜圖中各峰的保留時(shí)間與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間作比較，確定樣品色譜圖中各峰的性質(zhì)。用面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的百分含量。

1.4 檢測指標(biāo) 調(diào)查并記錄研究對(duì)象的年齡、性別、身高、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。抽取空腹靜脈血，按照臨床標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行血清三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、總膽固醇 （TC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷酰轉(zhuǎn)氨酶（GGT）、血清尿酸（UA）、肌酐（Cr）的檢測，所有生化指標(biāo)的檢測均用全自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。計(jì)量資料以表示，正態(tài)分布且方差齊的兩組資料比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊或偏態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，并進(jìn)行NAFLD危險(xiǎn)因素的非條件Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 NAFLD組BMI、ALT、AST、GGT、TC、TG、Cr、UA等指標(biāo)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HDL－C和LDL－C兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 一般臨床資料比較（）

表1 一般臨床資料比較（）

a：Mann－Whitney U 檢驗(yàn)；b：兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

項(xiàng)目 對(duì)照組（n＝110）NAFLD組（n＝105）F P BMI（kg／m2） 21.903±2.43726.173±2.751 －16.487a 0.000 ALT（U／L） 21.280±13.19639.040±24.368 －12.146a0.000 AST（U／L） 23.970±9.08430.790±13.767 －7.924a0.000 GGT（U／L） 22.340±21.37745.730±40.761 －13.547a0.000 TC（mmol／L） 4.460±0.8474.810±0.909 －4.982b 0.000 TG（mmol／L） 1.150±1.0922.580±1.938 －15.133a0.000 HDL－C（mmol／L） 1.430±5.6001.410±0.408 0.088b 0.930 LDL－C（μmol／L） 2.744±2.8162.992±0.649 －1.487b 0.138 Cr（μmol／L） 62.866±13.82368.343±14.597 －4.719b 0.000 UA（μmol／L） 294.716±77.825381.647±92.235 －11.416a 0.000

2.2 一般臨床資料的非條件Logistic回歸分析 經(jīng)非條件Logistic回歸分析，最后入選的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)分別為BMI、ALT、TG和UA。其中ALT和UA應(yīng)看做是NAFLD的結(jié)果而不是危險(xiǎn)因素，BMI（OR＝1.821）和 TG（OR＝1.904）的OR值均大于1，可以看作NAFLD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，見表2。

表2 一般臨床資料的非條件Logistic回歸分析

2.3 血漿游離脂肪酸組成比較 統(tǒng)計(jì)研究人群血漿游離脂肪酸水平，選取其中12種脂肪酸列入血漿游離脂肪酸組成譜。NAFLD組血漿飽和脂肪酸（SFA）和棕櫚酸（C16：0）水平高于對(duì)照組（P＜0.05），而單不飽和脂肪酸（PUFA）、亞油酸（C18：2n－6）、花生四烯酸（C20：4n－6）水平則低于對(duì)照組（P＜0.05）。其他種類血漿游離脂肪酸水平兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 血漿游離脂肪酸組成比較

2.4 血漿游離脂肪酸水平與NAFLD發(fā)生的相關(guān)性 經(jīng)非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，選取的12種脂肪酸中血漿C16：0（OR＝1.769）水平升高增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而C18：2n－6（OR＝0.855）和 C20：4n－6（OR＝0.181）水平升高則降低NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。統(tǒng)計(jì)研究過程中，本研究未發(fā)現(xiàn)其他血漿脂肪酸水平與NAFLD發(fā)生相關(guān)，見表4。

表4 血漿游離脂肪酸水平與NAFLD的相關(guān)性

3 討 論

近年來隨著生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生重要變化，高能量、高脂肪膳食攝入已經(jīng)成為一個(gè)普遍現(xiàn)象，肥胖和高脂血癥增多，脂肪肝的發(fā)生也隨之增多。本研究顯示NAFLD組的BMI、ALT、AST、GGT、TC、TG、CR、UA 等指標(biāo)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從非條件Logistic回歸分析結(jié)果可以看出，BMI和TG是NAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［7－9］。NAFLD的發(fā)生與肥胖有密切關(guān)系，由于肥胖者體內(nèi)脂肪組織增多，體內(nèi)脂肪酸和游離脂肪酸釋出增加，肝臟脂肪氧化磷酸化和脂肪酸β氧化受損使脂肪酸分解下降，TG合成增多集聚肝臟而形成脂肪肝［10］。高TG血癥時(shí)，體內(nèi)游離脂肪酸增多，增多的游離脂肪酸具有細(xì)胞毒性，它可造成肝細(xì)胞變性、壞死和炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生［11］；另外，增多的游離脂肪酸也會(huì)干擾周圍組織中胰島素與受體結(jié)合，導(dǎo)致胰島素抵抗的產(chǎn)生。因此，注意平衡膳食、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)、合理控制體質(zhì)量有助于預(yù)防NAFLD的發(fā)生。

脂肪酸是膳食脂肪的重要組成部分，也是體內(nèi)脂肪代謝的中間產(chǎn)物。脂肪酸根據(jù)飽和程度可以分為：SFA、MUFA、PUFA，PUFA又分為 n－3PUFA 和 n－6PUFA。本研究結(jié)果顯示，NAFLD組C16：0水平較高，可能是血漿中SFA含量增加的重要因素，C16：0水平高則增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。NAFLD組血漿PUFA、C18：2n－6、C20：4n－6水平均低于對(duì)照組，經(jīng)非條件Logistic回歸分析顯示，C18：2n－6、C20：4n－6水平升高則降低NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)在體外的研究也發(fā)現(xiàn)C16：0促進(jìn)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞脂肪蓄積，而C18：2n－6和C20：5n－3降低肝細(xì)胞的脂肪含量［12］。Barreyro等［13］研究發(fā)現(xiàn)SFA（C16：0和C18：0）在肝細(xì)胞內(nèi)過度聚積，可能造成肝細(xì)胞損傷。C18：2n－6是導(dǎo)致血膽固醇濃度下降的主要脂肪酸，它可以加速血漿中TC的轉(zhuǎn)化和排泄，因而可以降低血漿TC的濃度［14］。C18：2n－6還有降低血漿TG水平的作用，維持血脂代謝平衡［15］。C20：4n－6是合成前列腺素、前列腺環(huán)素、血栓烷素、白細(xì)胞三烯等二十碳衍生物的直接前體，這些生物活性物質(zhì)對(duì)脂質(zhì)代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究顯示對(duì)NAFLD有預(yù)防作用的PUFA主要是n－6PUFA中的C18：2n－6和C20：4n－6，而未見血漿n－3PUFA與NAFLD有關(guān)，這可能是由于重慶地區(qū)研究對(duì)象膳食中n－3PUFA攝入水平相對(duì)較低且差別不大。

［1］Breij LM，Kerkhof GF，Hokken－Koelega AC，et al.Accelerated infant weight gain and risk for non－alcoholic fatty liver disease in early adulthood［J］.World J Gastroenterol，2013，19（48）：9146－9155.

［2］de Alwis NM，Day CP.Non－alcoholic fatty liver disease：the mist gradually clears［J］.J Hepatol，2008，48（Suppl 1）：S104－S112.

［3］Williams CD，Stengel J，Asike MI，et al.Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis among a largely middle－aged population utilizing ultrasound and liver biopsy：aprospective study［J］.Gastroenterology，2011，140（1）：124－131.

［4］Fan JG，F(xiàn)arrell GC.Epidemiology of non－alcoholic fatty liver disease in China［J］.J Hepatol，2009，50（1）：204－210.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19（6）：483－487.

［6］Masood A，Stark KD，Salem N.A simplified and efficient method for the analysis of fatty acid methyl esters suitable for large clinical studies［J］.J Lipid Res，2005，46（10）：2299－2305.

［7］ZámbóV，Simon－SzabóL，Szelényi P，et al.Lipotoxicity in the liver［J］.World J Hepatol，2013，5（10）：550－557.

［8］唐彬，姚樹坤.非酒精性脂肪性肝炎患者血清L－FABP和TNF－α水平測定及其意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（15）：1696－1697，1700.

［9］邵小娟，王曉敏，王斌，等.巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換在NAFLD發(fā)生過程中的可能作用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（15）：1681－1684，1688.

［10］趙紫煙.非酒精性脂肪肝的危險(xiǎn)因素及脂肪肝診斷的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（10）：1522－1524.

［11］田曉媛.膳食脂肪酸與非酒精性脂肪肝［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（24）：3430－3432.

［12］田曉媛，張乾勇，冉莉，等.不同膳食脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞SREBP－1c表達(dá)及脂代謝的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（1）：66－69.

［13］Barreyro FJ，Kobayashi S，Bronk SF，et al.Transcriptional regulation of Bim by FoxO3Amediates hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Biol Chem，2007，282（37）：27141－27154.

［14］Koo SH.Nonalcoholic fatty liver disease：molecular mechanisms for the hepatic steatosis［J］.Clin Mol Hepatol，2013，19（3）：210－215.

［15］時(shí)皎皎，糜漫天，韋娜，等.不同脂肪酸構(gòu)成比對(duì)大鼠血脂影響的研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（9）：824－827.