Rag2敲除小鼠臟器重量、血液生理生化指標(biāo)及免疫細(xì)胞的研究

王 宇，吳旭穎，魏詔盛，吳金峰，劉會(huì)真，田玉書，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

Rag2是由白細(xì)胞介素4與costimuli(脂多糖等細(xì)胞因子)結(jié)合后表達(dá)于成熟小鼠B細(xì)胞，Rag2基因長度大約18 kb，在V(D)J基因重排和淋巴系細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵性作用[1-4]。Rag2 KO小鼠的表現(xiàn)型是嚴(yán)重的T/B細(xì)胞早期發(fā)育阻滯，T細(xì)胞停滯于CD3-CD4-CD8-CD25+階段，而B細(xì)胞停滯于B220- CD43+IgM- B細(xì)胞階段。它們的外周血沒有成熟的循環(huán)T/B淋巴細(xì)胞，這與人重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征SCID非常相似，并且都有V(D)J基因重排缺陷。

純合的Rag2 KO小鼠是整個(gè)Rag2蛋白編碼區(qū)缺失。但是，該小鼠可以生長繁殖。Rag2突變小鼠具有第三外顯子目標(biāo)基因的缺失。美國The Jackson Laboratory公司描述了純合的Rag2 KO小鼠、Rag2第三外顯子突變小鼠以及Rag2第三外顯子未發(fā)生突變的小鼠具有同樣的表型。鑒于該小鼠的這種表型，可用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤、炎癥反應(yīng)等多領(lǐng)域的生命科學(xué)研究。

該小鼠自國外引進(jìn)以來，飼養(yǎng)條件與國外發(fā)生了一定的變化，但是，我國還沒有關(guān)于該小鼠系統(tǒng)的基礎(chǔ)生理生化參數(shù)的研究和報(bào)道，本研究擬對(duì)Rag2 KO小鼠的臟器重量、血液生理生化指標(biāo)及免疫細(xì)胞進(jìn)行測定，為我國科研人員利用該小鼠進(jìn)行生命科學(xué)研究和生物醫(yī)藥研發(fā)提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取SPF級(jí)Rag2 KO小鼠5、10周齡各24只，雌、雄比例1:1，共計(jì)48只，用于臟器和血生理生化檢測；取6周齡的Rag2 KO小鼠4只，雌、雄比例1:1，用于免疫細(xì)胞檢測。所有動(dòng)物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2009-0004。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境

Rag2 KO小鼠均飼養(yǎng)在符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的隔離環(huán)境內(nèi)，隔離環(huán)境的潔凈度標(biāo)準(zhǔn)為5級(jí)，溫度控制為22℃～26℃，相對(duì)濕度為40%～70%，每小時(shí)換氣20次，明暗周期為12 h：12 h，動(dòng)物自由采食和飲水。

所用飲水、墊料均經(jīng)高壓滅菌，飼料為自行配制加工的全價(jià)顆粒繁殖飼料并經(jīng)60Co照射滅菌，該產(chǎn)品為北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)為小鼠繁殖飼料1035，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2009-0008。營養(yǎng)成分為：粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。水為酸化過濾自來水(ph=2.7～3.0)并經(jīng)121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，使用的墊料等物品均經(jīng)過132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換1次墊料，飼料和水自由攝取。每周更換1次墊料，進(jìn)出隔離環(huán)境的物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒，并嚴(yán)格遵守隔離系統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作及管理規(guī)程。

1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所解剖實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(京)2013-0019。

1.4 儀器及試劑

法國ABX Pentra DX 120血細(xì)胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑、美國貝克曼Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、美國BD公司流式細(xì)胞儀(FACS)、紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 體重和臟器重量的測定：實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱取重量。

1.5.2 血生化指標(biāo)測定：將剩余的全血取0.8 mL到離心管內(nèi)，3000 r/min，離心10 min后取血清，進(jìn)行血生化測定。15項(xiàng)血清生化指標(biāo)為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素(UN)、肌酐(CREA)、無機(jī)璘(P)、血鈣(Ca)。

1.5.3 血生理指標(biāo)測定：從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內(nèi)，進(jìn)行血生理測定。12項(xiàng)血生理指標(biāo)為：血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞%(LYM%)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)。

1.5.4 免疫細(xì)胞檢測方法：采用小鼠摘眼球取血法取300 uL外周血，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，將細(xì)胞用1% BSA/PBS洗兩次后分為兩管備用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min，另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min，洗后用流式細(xì)胞儀(FACS，Aria)檢測并用FCS Express V3.0軟件分析數(shù)據(jù)。免疫細(xì)胞測定：T細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B細(xì)胞(CD19+、B220+)、NK細(xì)胞(NK1.1+)、粒細(xì)胞(CD11b+)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，顯著水平為P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 Rag2 KO小鼠臟器檢測結(jié)果

表1可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠心臟、雙腎臟、肝臟、脾臟重量高于雌鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，10周小鼠腦、肺臟、脾臟、肝臟、心臟、雙腎臟重量高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.2 Rag2 KO小鼠血液生化檢測結(jié)果

由表2可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠AST、ALP、A/G、GLU高于雌性小鼠，CHO、TG、TP、GLOB低于雌性小鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，5周小鼠TG、UN、CREA、ALP高于10周小鼠，TBIL低于10周小鼠(P< 0.05)。

2.3 Rag2 KO小鼠血液生理檢測結(jié)果

由表3可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠PLT、PCT、WBC、LYM%高于雌性小鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，10周小鼠RDW低于5周小鼠，WBC高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.4 Rag2 KO小鼠免疫細(xì)胞測定結(jié)果

圖1顯示的是一只Rag2 KO小鼠外周血中T細(xì)胞及其亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞的百分比。由圖2 可見，Rag2 KO小鼠外周血無T細(xì)胞(0.36±0.15)%、CD4+T細(xì)胞(0.21±0.06)%、CD8+T細(xì)胞(0.23±0.07)%、CD19+ B細(xì)胞(0.28±0.04)%和B220+ B細(xì)胞(2.03±0.42)%)。NK細(xì)胞比例為(24.13±3.62)%，粒細(xì)胞比例為(57.20±3.85)%。

表1 Rag2 KO小鼠主要臟器重量(單位：g)

表2 Rag2 KO小鼠主要血生化指標(biāo)檢測結(jié)果

表3 Rag2 KO小鼠主要血生理指標(biāo)檢測結(jié)果

圖1 Rag2 KO小鼠外周血免疫細(xì)胞百分比

圖2 Rag2 KO小鼠免疫細(xì)胞百分比

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器重量是鑒定動(dòng)物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)，同時(shí)也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)避開小鼠6～8周齡性成熟激素調(diào)節(jié)較為不穩(wěn)定階段，為防止對(duì)生理生化及臟器產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)選取5周齡青年小鼠及10周齡壯年小鼠進(jìn)行對(duì)比研究[5]。本研究結(jié)果表明同性別不同周齡小鼠，隨著周齡增加各臟器重量遞增。同一周齡的雌性小鼠和雄性小鼠相比較，肝臟、脾臟、心臟及雙腎臟器重量雄性小鼠大于雌性小鼠。本研究結(jié)果與Jackson Laboratory 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠各臟器參數(shù)比較，除了脾臟偏低，其他臟器無顯著性差異[6-7]。脾臟偏低可能由于該小鼠為基因敲除小鼠引起，同時(shí)飼料、環(huán)境等因素也可引起該臟器重量偏低[8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Rag2 KO進(jìn)行了15種血液生化指標(biāo)的測定和初步統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，同周齡的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比，CHO、TP、GLOB三個(gè)指標(biāo)雄性小鼠高于雌性小鼠；AST、ALP、A/G、GLU四個(gè)指標(biāo)雌性小鼠高于雄性小鼠。5周與10周同性別的Rag2 KO小鼠相比，TBIL 隨著周齡增加而遞增，TG、UN、CREA、ALP隨著周齡增加而遞減。這是否是在一定時(shí)間內(nèi)(如3個(gè)月以上) 可能呈現(xiàn)規(guī)律性變化，還有待進(jìn)一步研究。可見年齡及性別因素對(duì)部分血液生化指標(biāo)的影響是十分明顯的，但是也與品種品系不同、飼養(yǎng)環(huán)境不同等多種因素有關(guān)，切不可一概而論[9-10]。本研究結(jié)果與Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠血液生化指標(biāo)比較，Jackson Laboratory、Charles river兩個(gè)公司公布的數(shù)據(jù)偏低，比SLC所公布的數(shù)據(jù)普遍偏高，可能由于動(dòng)物品系不同有一定差異，Rag-2 KO小鼠為免疫缺陷小鼠，在外界更易產(chǎn)生應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生一系列生理生化變化，且缺少免疫細(xì)胞，易對(duì)外界刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。而C57為正常健康小鼠，不會(huì)對(duì)外界產(chǎn)生過于敏感的反應(yīng)，生理生化值也相對(duì)穩(wěn)定。同時(shí)由于飼料及環(huán)境等因素的影響也會(huì)導(dǎo)致生化指標(biāo)的偏差[6-7,11]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Rag2 KO進(jìn)行了12種血液生理指標(biāo)的測定和初步統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，同周齡的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比，PLT、PCT、WBC、LYM% 雄性小鼠高于雌性小鼠；5周與10周同性別的Rag2 KO小鼠相比，RDW10隨著周齡增加而遞減，WBC隨著周齡增加而遞增。根據(jù)醫(yī)學(xué)資料顯示，RDW隨周齡增大而減少，可能由于貧血造成；同時(shí)，WBC隨周齡增加而增加，顯示白細(xì)胞炎癥增加。由于Rag2-KO為免疫缺陷小鼠，該兩個(gè)指標(biāo)的變化，初步推斷由于該品系小鼠的生物學(xué)特性導(dǎo)致。本研究結(jié)果與Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠部分血液生理指標(biāo)比較，無顯著差異[6-7,11]。

Rag2 KO小鼠表現(xiàn)型為嚴(yán)重的T/B細(xì)胞早期發(fā)育組滯。它的外周血沒有成熟的循環(huán)T/B淋巴細(xì)胞，但是存在NK細(xì)胞(NK1.1+)和粒細(xì)胞(CD11b+)，這與人重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征SCID非常相似[12]。由于該基因小鼠特殊繁殖方式，為避免母體的抗體對(duì)Rag2 KO小鼠免疫檢測造成干擾，特選離乳后2～3周動(dòng)物，即6周齡小鼠進(jìn)行檢測。因此我們通過標(biāo)記6周齡Rag2 KO小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗體檢測Rag2 KO小鼠體內(nèi)不同的免疫細(xì)胞情況，證實(shí)Rag2 KO小鼠表現(xiàn)為明顯的T、B細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷。Rag2 KO小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物，在異種移植及移植宿主的腫瘤研究和毒理學(xué)研究上得到了廣泛的應(yīng)用。

由于國內(nèi)Rag2 KO小鼠研究剛起步，因此未見此動(dòng)物臟器重量、血生理生化指標(biāo)的報(bào)道。本研究為生物醫(yī)學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Rag2 KO小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在國內(nèi)尚屬先例，所以對(duì)它的一些基本生物學(xué)特性尚缺乏系統(tǒng)的研究。由于此動(dòng)物現(xiàn)已形成一定規(guī)模，群體相對(duì)穩(wěn)定，其生物學(xué)特性和健康狀況也相對(duì)穩(wěn)定，因此，記錄和結(jié)果數(shù)據(jù)較為集中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該動(dòng)物的主要血液生化指標(biāo)的檢測具有一定的參考意義，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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