四氧嘧啶誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性高血糖小鼠模型建立及其穩(wěn)定性

陳 琳，樂 凱，茹 琴，田 香，熊 琪，馬寶苗，劉 璐，吳日輝，邢俊俏，王 寧，張 琨，趙小偉，陳 衛(wèi)，何 麗，歐陽康樂，司遠(yuǎn)仁，李超英,4,

(1.江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056； 2. 福格森(武漢)生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430050；3. 湖北省中山醫(yī)院，湖北 武漢 430032；4. 漢濟(jì)生物科技(武漢)有限公司，漢濟(jì)生物醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430075；)

保健食品安全性和功能評價(jià)是國家對保健食品安全監(jiān)管的一項(xiàng)重要措施[1]。在輔助降血糖功能試驗(yàn)評價(jià)中，成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性高血糖模型是前提，功能試驗(yàn)周期一般長達(dá)4～6周，因此保持該模型的穩(wěn)定性是評價(jià)工作順利進(jìn)行的重要保障。四氧嘧啶(alloxan，ALX)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性高血糖模型的方法因其能高度模擬人類糖尿病臨床表現(xiàn)而被國際上一貫用于糖尿病機(jī)制研究[2]，同時(shí)也是我國保健食品安全性和功能評價(jià)試驗(yàn)中采用的經(jīng)典造模方法[3]。影響該藥物造模成功的因素很多[4]，如動物品系[5, 6]、性別[7]、體重[8]、給藥途徑[9]、溶媒[10]、給藥劑量[11, 12]、禁食時(shí)間[13]等，專家學(xué)者對此也進(jìn)行了廣泛研究探討。其中，溶媒[10]和劑量[8, 11]對腹腔注射ALX致實(shí)驗(yàn)性高血糖小鼠模型的穩(wěn)定性研究通常為注射后7d[14]～30d[15]，針對這一研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)對腹腔注射ALX致實(shí)驗(yàn)性高血糖小鼠模型建立的溶媒及劑量因素進(jìn)行優(yōu)化組合，對小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、血糖曲線下面積(反映糖耐量水平)的穩(wěn)定性進(jìn)行了長達(dá)6周的動態(tài)觀察，同時(shí)測定血清胰島素水平及其組間差異，以期為輔助降血糖功能試驗(yàn)評價(jià)及實(shí)驗(yàn)性高血糖相關(guān)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明種成年小鼠160只，雌雄各半，6～8周齡，體重22～28 g，自由采食與飲水，由湖北省疾病預(yù)防與控制中心動物中心提供，生產(chǎn)合格證號為：SCXK(鄂)2008-0005，實(shí)驗(yàn)動物使用合格證號SYXK(鄂)2007-0042。

1.2 試劑與儀器

四氧嘧啶、葡萄糖、檸檬酸及檸檬酸鈉(分析純，Sigma，美國)，生理鹽水(雙鶴，中國)。安準(zhǔn)型血糖檢測儀及試紙條(長沙三諾，中國)，小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒(上海博谷，中國)，高速離心機(jī)(Thermo，美國)，酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，電子天平(上海梅特勒-托利多，中國)。

1.3 動物分組與干預(yù)方法

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為8組，每組各12只小鼠：A組：生理鹽水(normal saline，NS)對照組(注射NS)；B組：檸檬酸鈉緩沖液(sodium citrate-hydrochloric acid buffer solution，CS)對照組(注射pH 4.5的CS)；C組：NS + ALX 160 mg(注射NS配制的ALX 160 mg/kg 體重)；D組：NS + ALX 190 mg(注射NS配制的ALX 190 mg/kg 體重)；E組：CS + ALX 190 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 190 mg/kg 體重)；F組：CS + ALX 180 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 180 mg/kg 體重)；G組：CS + ALX 160 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 160 mg/kg 體重)；H組：CS + ALX 140 mg(注射pH 4.5的CS配制的ALX 140 mg/kg 體重)。所有組別小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，在造模前禁食不禁水16 h后檢測體重、空腹血糖及血糖曲線下面積的基礎(chǔ)值，然后采取單次腹腔注射(溶劑或藥物，0.2 mL/kg 體重)進(jìn)行造模，ALX配制均避光、現(xiàn)用現(xiàn)配。血糖高于10 mmol/L者確定為造模成功，計(jì)算各組成模率。所有組別小鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，動態(tài)檢測體重、空腹血糖及血糖曲線下面積，1次/周，共6周，觀察結(jié)束后收集小鼠血清保存于-20℃用于檢測血清胰島素水平。

1.4 小鼠血清胰島素水平檢測

實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒提供的說明書進(jìn)行，顯色終止后于450 nm波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相對濃度值，用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠存活率動態(tài)觀察

如圖1中所示，NS腹腔注射組或與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后6 周小鼠存活率穩(wěn)定在100%；NS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組及CS腹腔注射組，造模后小鼠存活率6 周穩(wěn)定在90%；CS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1 周小鼠存活率為67%，2～6 周逐步下降至47%，與NS對照組相比顯著下降，P<0.05；CS與ALX 180 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1 周小鼠存活率為73%，2～6 周維持穩(wěn)定在67%；CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠存活率6 周穩(wěn)定在75%，CS與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠存活率6周穩(wěn)定在70%，組間存活率相比無顯著性差異，P>0.05。

2.2 小鼠成模率動態(tài)觀察

如圖2所示，NS腹腔注射組或CS腹腔注射組，造模后6周小鼠成模率為0；NS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠1周成模率為0，2～6周為7%；NS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后2周小鼠成模率由0上升至40%，第3周降低至7%，第4周上升至15%，5～6周降低至7%，呈現(xiàn)較大波動；CS與ALX配伍腹腔注射組成模率與NS對照組相比顯著增高，P<0.05，其中，CS與ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后6周小鼠成模率穩(wěn)定在93%；CS與ALX 180 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1周小鼠成模率為87%，2～6周內(nèi)在67%至87%之間反復(fù)波動；CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后小鼠成模率1周小鼠成模率為70%，2～6周內(nèi)穩(wěn)定保持在60%至70%水平；CS與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射組，造模后1周小鼠成模率為47%，2～6周內(nèi)在47%至27%之間反復(fù)波動。

圖1 造模前后各組小鼠存活率動態(tài)變化曲線

圖2 各組小鼠成模率動態(tài)變化曲線

2.3 小鼠體重動態(tài)觀察

如圖3所示6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/kg 體重、ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射、CS腹腔注射或與ALX 140 mg/kg 體重配伍腹腔注射對小鼠體重及其穩(wěn)定性的影響，與NS對照組相比，差異無顯著性，P> 0.05；與NS對照組相比，CS與ALX 180、190 mg/kg 體重配伍會導(dǎo)致小鼠體重極顯著下降，P<0.01，CS與ALX 160 mg/kg 體重配伍會導(dǎo)致小鼠體重顯著下降，P<0.05。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

2.4 小鼠空腹血糖動態(tài)觀察

如圖4所示，造模后，NS對照組及NS+ALX 160 mg組，小鼠空腹血糖未見升高，6周內(nèi)呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；NS+ALX 190 mg組、CS對照組造模后小鼠空腹血糖呈一過性輕度升高，3周后下降至正常水平并呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；CS+ALX 140 mg組造模后小鼠空腹血糖較NS對照組顯著升高，2-6周呈波動性下降趨勢，至第6周空腹血糖仍顯著高于NS對照組(P< 0.05)；CS+ALX 160 mg組造模后小鼠空腹血糖較NS對照組顯著升高，2～6周呈穩(wěn)定保持高水平(15｀20 mmol/L)，至第6周空腹血糖仍顯著高于NS對照組(P<0.05)；CS+ALX 180 mg組及CS+ALX 190 mg組，造模后小鼠空腹血糖較NS對照組極顯著升高，2～6周呈穩(wěn)定保持極高水平，至第6周空腹血糖仍極顯著高于NS對照組(>25 mmol/L，P<0.01)。結(jié)果提示，6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/Kg體重、ALX 190 mg/Kg體重配伍腹腔注射NS、CS腹腔注射對小鼠空腹血糖及其穩(wěn)定性無顯著影響，CS與ALX 160～190 mg/Kg 體重配伍會導(dǎo)致小鼠空腹血糖顯著升高，ALX劑量越大，小鼠空腹血糖越高。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P < 0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P < 0.01

2.5 小鼠糖耐量水平動態(tài)觀察

如圖5所示，造模后，NS對照組及NS+ALX 160 mg組，小鼠血糖曲線下面積未見升高，6周內(nèi)呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；NS+ALX 190 mg組、CS對照組造模后小鼠血糖曲線下面積呈一過性輕度升高，3周后下降至正常水平并呈持續(xù)穩(wěn)定不變趨勢；CS+ALX 140 mg組造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組顯著升高，第2周下降，3～6周血糖曲線下面積仍顯著高于NS對照組(P<0.05)；CS+ALX 160 mg組及CS+ALX 180 mg組造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組極顯著升高，2-6周呈穩(wěn)定保持高水平(55～65 mmol/L)，至第6周血糖曲線下面積仍極顯著高于NS對照組(P<0.01)；CS+ALX 190 mg組，造模后小鼠血糖曲線下面積較NS對照組極顯著升高，2-6周呈穩(wěn)定保持極高水平，至第6周血糖曲線下面積仍極顯著高于NS對照組(P<0.01)。結(jié)果提示，6周觀察期內(nèi)，NS腹腔注射或與ALX 160 mg/Kg體重、ALX 190 mg/kg 體重配伍腹腔注射、CS腹腔注射對小鼠血糖曲線下面積及其穩(wěn)定性無顯著影響，CS與ALX 140～190 mg/kg體重配伍會導(dǎo)致小鼠血糖曲線下面積顯著升高，ALX劑量越大，小鼠血糖曲線下面積越高。

2.6 小鼠血清胰島素水平組間差異

如圖6所示，造模后第6周，NS對照組、CS對照組、NS+ALX 160 mg組、NS+ALX 190 mg組小鼠血清胰島素水平組間無差異；CS+ALX 140 mg組、CS+ALX 160 mg組及CS+ALX 180 mg組小鼠血清胰島素水平組間無差異，均顯著低于NS對照組，P<0.05，CS+ALX 190 mg組小鼠血清胰島素水平極顯著低于NS對照組，P<0.01。提示NS、CS單獨(dú)腹腔注射，NS與ALX 160或190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射均不會對造模后第6周小鼠血清胰島素水平有顯著影響，而CS與ALX 140、160、180及190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射均對造模后第6周小鼠血清胰島素水平有顯著降低作用(P<0.05)，其中以CS與ALX 190 mg/kg 體重聯(lián)合腹腔注射降低血清胰島素水平作用最為顯著(P<0.01)。

注：* 與NS對照組相比有顯著性差異，P<0.05；** 與NS對照組相比有極顯著性差異，P<0.01

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高和人口老齡化，糖尿病的發(fā)病呈逐年上升趨勢。建立理想的實(shí)驗(yàn)性糖尿病動物模型，無論對糖尿病機(jī)制的深入研究，還是保健食品及抗糖尿病新藥的開發(fā)都具有非常重要的實(shí)際意義。

ALX易與SH基(主要是半胱氨酸)發(fā)生反應(yīng)，而胰島的β細(xì)胞中SH基含量較其他組織多，故ALX可以選擇性地?fù)p害胰島β細(xì)胞，通過產(chǎn)生超氧自由基破壞β細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，并激活多聚核糖體合成酶的活性，從而導(dǎo)致mRNA功能受損，細(xì)胞合成前胰島素減少，最終導(dǎo)致胰島素缺乏性的高血糖[7]。利用ALX制造高血糖模型能高度模擬人類糖尿病臨床表現(xiàn)[2]，同時(shí)具有胰島外分泌不受損傷；幾乎所有常用實(shí)驗(yàn)動物都可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；胰島的β細(xì)胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰島組織的再生和功能的恢復(fù)，動物不用注射胰島素也能存活等優(yōu)點(diǎn)而被國際上廣泛采納[16]。

四氧嘧啶造模成功受諸多因素影響，例如動物品系、性別、體重、給藥途徑、溶媒、給藥劑量、禁食時(shí)間等，專家學(xué)者對此也進(jìn)行了廣泛研究探討，研究發(fā)現(xiàn)這些因素對造模成功率的影響各異[9, 17]，已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中溶媒[10]的選擇、藥物的劑量[8, 11]仍是關(guān)鍵的影響因素，文獻(xiàn)中使用ALX造模劑量從100 mg/kg 體重到300 mg/kg 體重(小鼠)[7, 8, 11]均有報(bào)道且結(jié)果各異，可能與各文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)條件各異以及動物個(gè)體差異有關(guān)[17, 18]。ALX水溶液的穩(wěn)定性取決于pH值，pH 4.5的CS減少ALX的氧化分解有利于藥物的溶解以及在體內(nèi)的吸收利用從而提高成模率[10]。我們的實(shí)驗(yàn)中以pH值為4.5的CS為溶劑配制ALX，并且避光、現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部以此為溶液的組別造模后成模率及其穩(wěn)定性都顯著高于以生理鹽水為溶劑的組別(無論藥物濃度高低)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，造模后6周內(nèi)血糖值穩(wěn)定維持在成模水平(>10 mmol/L)，因此我們認(rèn)為pH值為4.5的CS為溶劑是造模成功及維持模型長期穩(wěn)定性的必要條件。

最重要的是，在輔助降血糖功能試驗(yàn)評價(jià)中，成功構(gòu)建糖尿病模型是前提，而功能試驗(yàn)周期一般長達(dá)4～6周，因此，保證該模型的穩(wěn)定性，是該項(xiàng)評價(jià)工作順利進(jìn)行的重要保障和前提。目前大多數(shù)文獻(xiàn)僅考察了上述相關(guān)因素對造模率等指標(biāo)7～30d期間的影響[14, 15]。針對這一研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)對腹腔注射ALX致實(shí)驗(yàn)性高血糖小鼠模型建立的溶媒及劑量因素進(jìn)行優(yōu)化組合，對小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、血糖曲線下面積(反映糖耐量水平)的穩(wěn)定性進(jìn)行了長達(dá)6周的動態(tài)觀察，同時(shí)測定血清胰島素水平及其組間差異。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALX(以pH值為4.5 CS為溶劑)濃度達(dá)到190 mg/kg 體重時(shí)，6周內(nèi)成模率(93%)，空腹血糖(>25 mmol/L)及血糖曲線下面積(>70 mmol/L)較持續(xù)穩(wěn)定在高水平，但體重(27g)、動物存活率(47%)及血清胰島素水平(19 mIU/L)極顯著降低(P<0.01)，提示該劑量可能會因動物損耗過大、小鼠胰腺及其胰島分泌胰島素功能被不可逆損害，高血糖狀態(tài)不可逆轉(zhuǎn)而不適用于輔助降血糖功能試驗(yàn)研究。藥物濃度在140、160、180 mg/kg 體重時(shí)，6周內(nèi)小鼠空腹血糖(15～25 mmol/L)及血糖曲線下面積(40～60 mmol/L)動物成模率(40%～73%)、存活率(67%～75%)及體重(29～41g)持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，血清胰島素水平(21 mIU/L)顯著降低(P<0.05)，其中尤以160 mg/kg 體重組各項(xiàng)指標(biāo)最為穩(wěn)定，可用于輔助降血糖功能試驗(yàn)的研究，而140及180 mg/kg 體重組各項(xiàng)指標(biāo)波動較大可能會影響試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

綜上，我們的實(shí)驗(yàn)選擇體重22～28 g 的昆明小鼠，禁食16 h，并用pH值為4.5的CS溶解的160 mg/kg 體重 ALX腹腔單次注射，連續(xù)動態(tài)觀察6周，獲得成模率較高、存活率較高、空腹血糖及血糖曲線下面積較持續(xù)穩(wěn)定在成模水平，血清胰島素水平下降但不喪失的糖尿病小鼠模型，可用于實(shí)驗(yàn)性糖尿病的基礎(chǔ)研究及輔助降血糖的功能研究。

我們通過對關(guān)鍵因素的不同組合，動態(tài)觀察成模后6周的小鼠成模率、存活率、體重、空腹血糖、糖耐量變化情況，并檢測血清胰島素水平，從穩(wěn)定性及胰島β細(xì)胞功能角度來評價(jià)組間差異，篩選出造模藥物ALX最適劑量，更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性，為輔助降血糖功能試驗(yàn)的準(zhǔn)確評價(jià)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和保障。

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