達(dá)瑪烷苷元對(duì)睡眠干擾所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

卜蘭蘭, 石 哲，武宏偉，盧 聰、王克柱，李瑩輝，曲麗娜，劉新民

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 病理學(xué)教研室，湖南，長(zhǎng)沙 410208；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中國(guó)航天員中心航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；4.湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410331)

人參是現(xiàn)代藥理研究最多和最充分的傳統(tǒng)中藥之一，而以改善各種學(xué)習(xí)記憶障礙的研究報(bào)導(dǎo)最多。現(xiàn)代研究證明人參皂苷為人參的主要活性成分，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有多種調(diào)節(jié)作用，如改善學(xué)習(xí)記憶障礙、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、興奮中樞等。研究表明，人參皂苷Rg1、Rb1能改善多種學(xué)習(xí)記憶障礙模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙[1-3]，保護(hù)多種條件下的神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡[4-6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1、Rb1對(duì)睡眠干擾大鼠認(rèn)知能力有改善作用，人參皂苷Rg1、Rb1、Rh1、PPT對(duì)東莨菪堿模型小鼠認(rèn)知能力有改善作用[7,8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究人參苷元類(lèi)化合物DS-1226對(duì)睡眠干擾致認(rèn)知障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為改善睡眠障礙致學(xué)習(xí)記憶損害的藥物研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物

DS-1226，dammarane sapogenins，成分：原人參二醇[20(S)-aglycone protopanaxadiol, aPPD]，原人參三醇[20(S)-aglycone protopanaxatriol, aPPT]，人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)，PAM120等。成分含量：aPPD >12%，aPPT >26%，Rh2 >8%。由加拿大天馬藥業(yè)集團(tuán)惠贈(zèng)。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，5-6周齡，體重22±2 g，130只，SPF級(jí)，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)[SCXK-(軍)2007-004]。使用合格證號(hào)：[SYXK( 京) 2003-0009]。

1.3 儀器

小鼠自主活動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)、小鼠Morris水迷宮計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制和圖像分析處理系統(tǒng)、小鼠避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)、滾筒式大小鼠睡眠干擾儀均由中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研發(fā)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

2.1.1 分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法分為水迷宮組(環(huán)境對(duì)照組，模型組，DS-1226低、中、高劑量組)和避暗組(環(huán)境對(duì)照組，模型組，DS-1226低、中、高劑量組)，共10組，每組13只。

2.1.2 給藥：DS-1226低劑量18.75 mg/kg，中劑量37.5 mg/kg，高劑量75 mg/kg。分析天平稱(chēng)取藥物，加蒸餾水配成混懸液，0.2 mL/10 g灌胃。環(huán)境對(duì)照組及模型組給等體積蒸餾水。造模開(kāi)始前(8 am)開(kāi)始給藥，每天1次。行為學(xué)檢測(cè)期間，每只動(dòng)物檢測(cè)前1 h給藥。給藥持續(xù)直至行為學(xué)檢測(cè)完成。

2.2 睡眠干擾實(shí)驗(yàn)

每天3 h ( 8～11 am)，連續(xù)3 d滾筒適應(yīng) ( 1 min/r，間隔5 min )后，將模型組及各給藥組動(dòng)物灌胃給藥后放入滾筒(8 AM)開(kāi)始干擾。滾筒以1 min/r 間隔5 min模式[9]運(yùn)轉(zhuǎn)并開(kāi)始計(jì)時(shí)。15 d時(shí)間到(8 am)取出水迷宮/避暗測(cè)試組與其環(huán)境對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行相應(yīng)行為學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后，將干擾組動(dòng)物放回滾筒繼續(xù)干擾(除行為學(xué)檢測(cè)期間取出動(dòng)物外，其余時(shí)間動(dòng)物均在滾筒中)。如此直至相應(yīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束。

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

睡眠干擾15 d時(shí)間到(8 am)后，自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。

小鼠Morris水迷宮計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制和圖像分析處理系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)室原有儀器[10]基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)，由一個(gè)不銹鋼噴塑圓柱形水池(直徑100 cm，高38 cm)和圖像采集分析系統(tǒng)組成。平臺(tái)直徑6 cm，高14 cm。按東西南北將水池劃分為4 象限( NE，SE，SW，NW)，象限池壁圓弧中點(diǎn)為動(dòng)物入水點(diǎn)。向池中注水并用墨汁調(diào)黑保證目標(biāo)準(zhǔn)確識(shí)別。軟件記錄動(dòng)物游泳軌跡，用于指標(biāo)提取和分析。

2.3.1 定位航行: Day1-6: 平臺(tái)固定于NE 象限中心，水面下1.5 cm。實(shí)驗(yàn)室物品及人員位置固定作為小鼠空間參照物。每天訓(xùn)練3次，每次從不同入水點(diǎn)( SE、SW、NW) 將動(dòng)物面向池壁放入水中。檢測(cè)時(shí)間90 s，在臺(tái)上停留超過(guò)2 s視為尋臺(tái)成功，每次測(cè)試前將動(dòng)物放在臺(tái)上適應(yīng)10 s (前適應(yīng))，測(cè)試完畢無(wú)論尋臺(tái)是否成功均將其放在臺(tái)上適應(yīng)10 s (后適應(yīng))。將動(dòng)物入水到尋臺(tái)成功所需時(shí)間記作潛伏期，尋臺(tái)失敗潛伏期記90 s。用潛伏期評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)能力。

2.3.2 空間探索:Day 7: 撤去平臺(tái)，從實(shí)臺(tái)所在象限對(duì)角象限SW入水。以90 s內(nèi)穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限游程比率、目標(biāo)象限時(shí)間比率評(píng)價(jià)動(dòng)物空間記憶能力。

2.4 避暗實(shí)驗(yàn)

睡眠干擾15 d時(shí)間到(8 am)后，自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行避暗訓(xùn)練。

小鼠避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)[11]由避暗測(cè)試箱和圖像采集分析系統(tǒng)組成。避暗測(cè)試箱為封閉結(jié)構(gòu)，內(nèi)含兩個(gè)測(cè)試箱，每個(gè)測(cè)試箱分明暗兩室(20 cm × 12 cm × 60 cm)，兩室之間均有一個(gè)小門(mén)(5 cm × 3 cm)，底部為可獨(dú)立控制通斷電的不銹鋼柵欄，應(yīng)用軟件控制實(shí)驗(yàn)流程并自動(dòng)分析動(dòng)物活動(dòng)信息，提取指標(biāo)。

2.4.1 避暗訓(xùn)練:Day1: 將動(dòng)物從明室放入自由活動(dòng)5 min后取出。設(shè)置參數(shù): 再現(xiàn)模式B(攝像頭識(shí)別到動(dòng)物在暗室，暗室柵欄通電，動(dòng)物離開(kāi)，暗室斷電)、刺激電壓31V、實(shí)驗(yàn)時(shí)間5 min。將動(dòng)物放入暗室開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物遭受電擊逃到明室。以5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(第1次被電不計(jì)入錯(cuò)誤次數(shù))，潛伏期(第1次從暗室到明室的時(shí)間)、暗室(錯(cuò)誤區(qū))時(shí)間、明室(安全區(qū))時(shí)間、暗室路程評(píng)價(jià)動(dòng)物避暗學(xué)習(xí)能力。

2.4.2 避暗檢測(cè):Day 2: 避暗訓(xùn)練后24 h進(jìn)行。參數(shù)設(shè)置同前。將動(dòng)物放入明室開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，以5 min 內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(進(jìn)入暗室的次數(shù))，潛伏期(第1次從明室到暗室的時(shí)間)、暗室時(shí)間、明室時(shí)間、暗室路程評(píng)價(jià)動(dòng)物避暗記憶能力。

2.5 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

睡眠干擾15 d時(shí)間到(8 am)，水迷宮定位航行Day 1/避暗訓(xùn)練Day 1前進(jìn)行。

小鼠自主活動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)[12]由一個(gè)封閉箱體(80 cm × 80 cm × 155 cm)、4個(gè)可移動(dòng)錐桶(底直徑30 cm，上口直徑40 cm，高60 cm) 和圖像采集分析系統(tǒng)組成。檢測(cè)時(shí)，將小鼠沿壁放入桶內(nèi)，設(shè)定參數(shù)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。軟件自動(dòng)采集分析動(dòng)物10 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡，通過(guò)總路程、平均速度、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、靜息總時(shí)間反映動(dòng)物自主活動(dòng)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠水迷宮成績(jī)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組定位航行D5、D6潛伏期增加(P<0.05)；與模型組和低劑量組比較，DS-1226中劑量組D6潛伏期降低(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226高劑量組D1-D6潛伏期降低(P<0.01)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組D2、D4潛伏期降低(P<0.05)，D1、D3、D5、D6潛伏期明顯降低(P<0.01)；與中劑量組比較，DS-1226高劑量組D1潛伏期降低(P<0.05)，D2-D5潛伏期明顯降低(P<0.01)。

如表2示，與對(duì)照組比較，模型組目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)、目標(biāo)象限游程比率減少(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226高劑量組目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)增加(P<0.01)、目標(biāo)象限游程比率和目標(biāo)象限時(shí)間比率增加(P<0.05)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組目標(biāo)象限游程比率增加(P<0.05)；與中劑量組比較，DS-1226高劑量組目標(biāo)象限穿臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。

表1 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠定位航行潛伏期的影響(n=13)

表2 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠空間探索的影響(n=13)

表3 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠避暗學(xué)習(xí)的影響(n=13)

表4 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠避暗鞏固的影響(n=13)

表5 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠自主活動(dòng)的影響(n=13)

4.2 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠避暗成績(jī)的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組錯(cuò)誤次數(shù)、暗室路程增加(P<0.01)，暗室時(shí)間、暗室靜息時(shí)間增加(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226低劑量組錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05)，暗室路程減少(P<0.01)，DS-1226中劑量組錯(cuò)誤次數(shù)、暗室路程減少(P<0.01)，DS-1226高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)、暗室路程減少(P<0.01)，暗室時(shí)間、暗室靜息時(shí)間減少(P<0.05)，明室時(shí)間增加(P<0.05)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組暗室時(shí)間及暗室靜息時(shí)間減少，明室時(shí)間增加(P<0.01)。

如表4示，模型組與對(duì)照組以及各給藥組與模型組之間，錯(cuò)誤次數(shù)、明室時(shí)間、暗室時(shí)間、潛伏期、暗室路程、暗室靜息時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4.3 DS-1226對(duì)睡眠干擾小鼠自主活動(dòng)的影響

如表5示，與對(duì)照組比較，模型組在以上各指標(biāo)上無(wú)差異；與模型組比較，DS-1226低劑量組總路程、平均速度、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間增加(P<0.05)，DS-1226中、高劑量組總路程、平均速度、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間均增加(P<0.01)。

5 討論

人參是五加科植物人參Panax ginseng C. A. Mey. 的根?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》上經(jīng)(品)中記載，人參“主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開(kāi)心益智。久服，輕身延年”。因其作用廣泛神奇享有“百草之王”的美譽(yù)而備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。關(guān)于其開(kāi)心益智作用的研究也成了熱門(mén)。隨著現(xiàn)代分離技術(shù)和分析技術(shù)的進(jìn)步，人參的化學(xué)成分得到進(jìn)一步闡明，人參皂苷被認(rèn)為是人參的主要有效物質(zhì)。有研究表明，口服人參皂苷對(duì)睡眠干擾大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損有明顯的保護(hù)作用[13]。另有研究表明，口服人參皂苷Rb1、腹腔注射人參皂苷Rd對(duì)東莨菪堿和環(huán)己米特所致的小鼠獲得性及鞏固性記憶障礙均具有明顯的改善作用[14]。在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選用人參皂苷堿水解后得到的人參次苷和人參苷元混合物DS-1226，探索其對(duì)滾筒法睡眠干擾致學(xué)習(xí)記憶損害的影響。

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睡眠干擾一定時(shí)間(15 d)后會(huì)造成動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。DS-1226高劑量(75 mg/kg)給藥則可以顯著改善小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，效果優(yōu)于中劑量。避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠避暗學(xué)習(xí)能力受損，DS-1226低、中、高三個(gè)劑量給藥均可改善造模動(dòng)物避暗學(xué)習(xí)能力，且高劑量?jī)?yōu)于低、中劑量。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、Rb1可以提高東莨菪堿癡呆動(dòng)物的水迷宮空間定位學(xué)習(xí)和記憶能力[15]，人參莖葉皂甙對(duì)睡眠干擾大鼠“Y”迷宮空間分辨學(xué)習(xí)能力有明顯改善作用[16]。人參皂苷的主要促智成分Rb1和Rg1可增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)的功能，增加腦突觸受體對(duì)3H-膽堿的攝取，增加乙酰膽堿的合成與釋放[17]。睡眠干擾后大鼠腦干中縫核群5-HT明顯增加且隨著擾時(shí)間延長(zhǎng)而加大，連續(xù)口服人參皂甙可使短時(shí)間干擾大鼠腦中縫核群5-HT增加，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間干擾，則使5-HT累積程度減輕[18]。還有研究報(bào)道，人參皂苷對(duì)中樞5-HT的影響呈雙向性,中樞5-HT能系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響是與膽堿能系統(tǒng)交互作用的結(jié)果，5-HT不但作為遞質(zhì)，而且作為調(diào)質(zhì)發(fā)揮作用[19]。張均田等為評(píng)價(jià)人參Rg1的益智作用，建立了多種記憶障礙模型，包括老年鼠、應(yīng)激鼠、缺血-再灌注、東莨菪堿及β淀粉樣蛋白等所致的認(rèn)知障礙，研究證明Rg1通過(guò)多種途徑和機(jī)制增加神經(jīng)可塑性，如提高突觸效能和結(jié)構(gòu)可塑性、中樞乙酰膽堿含量和M-膽堿受體密度增加和FOS蛋白、BDNF表達(dá)增加[20-22]。DS-1226改善睡眠干擾動(dòng)物空間定位學(xué)習(xí)記憶能力及避暗學(xué)習(xí)能力可能與以上機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。至于避暗鞏固結(jié)果顯示模型組避暗記憶能力未受損害，各給藥組與模型組之間避暗記憶也無(wú)差別，可能與電擊這種恐怖記憶一旦獲得就很難忘記有關(guān)[23]。

從自主活動(dòng)結(jié)果來(lái)看，睡眠干擾15d對(duì)ICR小鼠自主活動(dòng)影響較小。這也與前期研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)閯?dòng)物對(duì)滾筒滾動(dòng)已經(jīng)產(chǎn)生了適應(yīng)，同時(shí)也再次驗(yàn)證了滾筒法睡眠干擾結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性[9]。人參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)靜和興奮雙向調(diào)節(jié)作用與用藥時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)、用藥劑量及人參不同成分有關(guān)[24]。DS-1226給藥各劑量組動(dòng)物自主活動(dòng)均顯示總體活動(dòng)增加，這可能與以上三種因素相關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DS-1226口服給藥可以改善滾筒法睡眠干擾15 d導(dǎo)致的小鼠空間定位學(xué)習(xí)、記憶能力及避暗學(xué)習(xí)能力障礙，且高劑量(75 mg/kg)效果最為明顯，可為益智中藥的研究提供參考。

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