TRPV3在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響

盧彥欣，岳續(xù)朋，蔡樹春，張巨峰

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

膀胱癌為男性第4大腫瘤疾病，是我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)高發(fā)腫瘤之一，并且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1-4]。對(duì)膀胱癌發(fā)病機(jī)制以及疾病發(fā)生過程中體內(nèi)各蛋白表達(dá)變化的研究有助于臨床膀胱癌診斷，治療和新藥的研發(fā)[5]。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型(transient receptor potential vanilloid,TRPV)為非選擇性陽離子通道，主要通透鈣離子[6-7]。鈣離子作為第二信使，參與人體內(nèi)多種生理、病理活動(dòng)，包括神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及腫瘤發(fā)生等[8-9]。TRPV3是TRPV成員之一，主要在感覺神經(jīng)細(xì)胞和皮膚角化細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)在腦、肝、膀胱等組織器官中也有表達(dá)[10]。目前關(guān)于TRPV3的研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚中，關(guān)于TRPV3在腫瘤中的研究尚少，我們通過檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中TRPV3 mRNA 表達(dá)水平和生物學(xué)功能，探討TRPV3在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以及TRPV3作為臨床膀胱癌診療以及新藥研發(fā)的潛質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器 膀胱癌細(xì)胞系RT4，UM-UC-3，SW780，J82，TCC-SUP，T24和人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞系系本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，源于ATCC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自Takara公司，WST-1試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，麝香草酚(Thymol)購(gòu)自Sigma。

本課題用到的主要實(shí)驗(yàn)儀器有CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)熱電3111型)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus CKX41型)，熒光定量PCR儀(Bio-RAD Chromo4)，酶標(biāo)儀(Bio—RAD Model 680型)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time RT-PCR)檢測(cè)TRPV3 mRNA 的表達(dá) 膀胱癌細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿，長(zhǎng)至約95%滿后，1×PBS(pH=7.4)清洗3遍，加入1 mL TRIzol (Invitrogen)試劑，室溫放置5 min，吸取細(xì)胞裂解液，加入200 μL氯仿，混勻，12 000 rpm在4 ℃離心10 min；離心后吸取上層液體，加入500 μL異丙醇，混勻，冰浴10 min，12 000 rpm在4 ℃離心10 min；棄掉上清，70%乙醇溶液清洗沉淀，10 000 rpm在4℃離心5 min，棄上清，空氣干燥，加入適量DEPC水溶解沉淀，即為細(xì)胞總RNA，利用NanoDrop測(cè)量總RNA吸光度，以濃度較高，A(260/280)在1.8～2.0的總RNA為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件根據(jù)TAKARA Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒說明書進(jìn)行，所得cDNA置4 ℃?zhèn)溆?。Real time PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq(2×)，12.5 μL；cDNA模板(稀釋10倍)，2 μL；引物(20 μmol·L- 1)，各1 μL，加 ddH2O至總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；進(jìn)入溶解曲線階段。TRPV3和GAPDH引物序列(見表1)。每個(gè)樣本設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，TRPV3 mRNA相對(duì)表達(dá)量通過相對(duì)定量分析法2-△△Ct計(jì)算。

表1引物序列

1.3 細(xì)胞增殖測(cè)定實(shí)驗(yàn) 利用WST-1試劑盒檢測(cè)TRPV3對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響。膀胱癌細(xì)胞計(jì)數(shù)并以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度傳代與96孔板中，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞處理后0、24、48、72 h分別加入含10 μL WST-1((博士德，武漢)的培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(λ=450 nm和λref=630 nm)。

1.4 細(xì)胞遷移能力測(cè)定實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為300 μmol·L-1TRPV3激動(dòng)劑Thymol組和等量DMSO對(duì)照組。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌細(xì)胞分別接種于30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)皿底部(約90%)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，利用無菌200 μL吸頭垂直于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，在單層細(xì)胞上直線劃痕，為便于標(biāo)記，本實(shí)驗(yàn)采用的是十字劃痕，1×PBS(pH=7.4)清洗細(xì)胞，更換為含5%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在劃痕后0、6 h采用倒置顯微鏡觀察劃痕寬度并用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄劃痕愈合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TRPV3在膀胱癌中低表達(dá) 相對(duì)于人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1，TRPV3在6株膀胱癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯降低，降低倍數(shù)不等，最明顯的為UM-UC-3，mRNA表達(dá)降低達(dá)數(shù)萬倍，T24細(xì)胞降低倍數(shù)最少，但也有數(shù)百倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.0001)(見圖1)。

2.2 TRPV3對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響 采用WST-1方法檢測(cè)TRPV3通道激動(dòng)劑Thymol對(duì)膀胱癌細(xì)胞系增殖能力的影響。結(jié)果顯示應(yīng)用300 μmol·L-1Thymol處理后的細(xì)胞增殖速度明顯變慢，細(xì)胞增殖曲線變緩(見圖2)。

2.3 TRPV3對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響 應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Thymol激活TRPV3通道后對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響。細(xì)胞的遷移生長(zhǎng)可使細(xì)胞劃痕的寬度變窄，以此反映細(xì)胞遷移能力的強(qiáng)弱。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度變化情況。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，Thymol實(shí)驗(yàn)組可明顯抑制細(xì)胞遷移，劃痕愈合速度變慢，劃痕寬度最大。

以GAPDH為內(nèi)參，SV-HUC-1細(xì)胞株中基因表達(dá)相對(duì)量為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定為1，其他細(xì)胞株中TRPV3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與SV-HUC-1相比較。(***P<0.001)。圖1 Real time RT-PCR檢測(cè)TRPV3 mRNA在膀胱癌以及正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá)

SW780細(xì)胞株：0 h，P>0.05；24 h，P>0.05；48 h，P<0.001；72 h，P<0.001。TCCSUP細(xì)胞株：0 h，P>0.05；24 h，P>0.05；48 h，P<0.01；72 h，P<0.001。圖2 Thymol激活TRPV3通道抑制膀胱癌細(xì)胞系SW780和TCCSUP的增殖

箭頭標(biāo)注劃痕寬度，***P<0.0001。 圖3 Thymol激活TRPV3通道抑制膀胱癌細(xì)胞系SW780的遷移能力

3 討論

膀胱癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中男性發(fā)病比例占總發(fā)病人數(shù)的80%，輕者嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，重者可直接威脅患者生命[4]。膀胱癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)，多因素參與的過程，同時(shí)有多個(gè)基因，多分子參與調(diào)控。雖然近年來對(duì)膀胱癌的研究取得了一個(gè)又一個(gè)突破性的結(jié)果，但是對(duì)其發(fā)生的分子機(jī)制的研究仍在不斷的探索之中。目前已證實(shí)在膀胱癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中表達(dá)發(fā)生變化并發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子有整合素相關(guān)激酶(integrin-linked kinase，ILK)[11], N-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-methyltransferase，NNMT)[12], 微小染色體維持蛋白(Mcm5)[13]等。

瞬時(shí)感受器電位通道是一類廣泛分布細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的非選擇陽離子跨膜蛋白質(zhì)，廣泛表達(dá)于多種組織器官中，如腦、脊髓、肝、肺、腎等，參與多種生理活動(dòng)，如溫度感覺、觸覺，感受外部激素，生長(zhǎng)發(fā)育過程，調(diào)節(jié)鈣平衡以及細(xì)胞分化，細(xì)胞凋亡等[6-7,14-15]。迄今為止已有超過30個(gè)TRP家族成員被克隆，分為7個(gè)亞族，分別是TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP和TRPV。其中TRPV亞家族包含6個(gè)成員，TRPV1-4通道為熱敏感通道，可被不同的溫度的溫?zé)岽碳ぜせ?，TRPV3能被溫?zé)?32℃和39℃)和一系列非熱性外源化合物激活，如薄荷(Peppermint)、樟腦(Camphor)、磷脂酶C(PLC) 、2-APB、一氧化氮(N0)和麝香草酚(Thymol)等[16-18]。TRPV3參與多種生物學(xué)活動(dòng)，如溫度覺，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)等，并可能與惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有關(guān)[19-20]。為闡明TRPV3在膀胱癌發(fā)生過程中的作用，我們檢測(cè)了TRPV3在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平以及TRPV3對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

我們首先利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)6株膀胱癌細(xì)胞與人膀胱上皮永生化細(xì)胞中TRPV3基因表達(dá)水平，TRPV3的mRNA在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞明顯下降，下降倍數(shù)最高可達(dá)數(shù)萬倍。提示TRPV3通道的激活或者通道表達(dá)量的升高可能在膀胱癌中起到抑癌的作用。我們利用TRPV3通道激活劑Thymol激活細(xì)胞中的TRPV3通道，觀察膀胱癌細(xì)胞功能的變化。細(xì)胞內(nèi)加入300 μmol·L-1的Thymol后，細(xì)胞被TRPV3被大量激活，陽離子尤其Ca2+內(nèi)流，膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相對(duì)對(duì)照細(xì)胞明顯變緩，增殖能力明顯受到抑制。我們進(jìn)一步利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)了TRPV3激活后，膀胱癌細(xì)胞遷移能力的變化。用含有300 μmol·L-1Thymol 培養(yǎng)基培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞劃痕愈合能力明顯變?nèi)?，?xì)胞遷移能力降低，提示TRPV3通道功能的增強(qiáng)可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TRPV3基因在膀胱癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平明顯降低。此外，激活TRPV3通道可明顯降低膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移速度。我們初步的研究結(jié)果表明，TRPV3參與了膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程，并在其中扮演抑癌基因的角色，為臨床膀胱癌的診療和新藥研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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