堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖

李會(huì)端+秦志玉

摘要：采用堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖，用顯色法進(jìn)行定性檢驗(yàn)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定提取液中多糖的含量并計(jì)算提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)初步探究了氫氧化鈉濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)試驗(yàn)條件對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)最終確定堿液冷提法提取程海螺旋藻中多糖的最佳試驗(yàn)條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，氫氧化鈉濃度0.4 mol/L、料液比1 ∶25、提取時(shí)間2 h為較佳提取條件，測(cè)得程海螺旋藻中多糖的提取率為4524%。

關(guān)鍵詞：堿液冷提法；鈍頂螺旋藻；多糖；提取工藝；提取率

中圖分類(lèi)號(hào)： S937.3；R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0255-03

收稿日期：2013-09-23

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2012FD050）；楚雄師范學(xué)院科學(xué)研究基金（編號(hào)：11YJGG01）。

作者簡(jiǎn)介：李會(huì)端（1983—），女，河北寧晉人，博士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物的化學(xué)成分分析及應(yīng)用研究。 E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。多糖是指由10個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連成的高分子聚合物，是生命賴以存在的四大基本物質(zhì)之一，按其來(lái)源可分為植物多糖、動(dòng)物多糖、微生物多糖、藻類(lèi)多糖，其中植物多糖和微生物多糖研究較多，藻類(lèi)多糖研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)多糖具有顯著的抗病毒、抗腫瘤功能，能抑制癌細(xì)胞合成和增殖，提高肌體免疫力，從藻類(lèi)中提取的多糖類(lèi)藥物具有顯著的抗艾滋病的功效[1]。對(duì)多糖的研究已成為21世紀(jì)醫(yī)藥界的熱門(mén)領(lǐng)域。螺旋藻屬于藍(lán)藻門(mén)藍(lán)藻綱螺旋藻屬，螺旋藻含有多種生物活性物質(zhì)，具有重要的保健功能和藥用價(jià)值，在食品保健、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有廣泛應(yīng)用[2]。多糖類(lèi)化合物是螺旋藻中重要的生物活性物質(zhì)之一，對(duì)其進(jìn)行提取和應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究具有重要的研究?jī)r(jià)值。多糖類(lèi)化合物的提取方法有熱水浸提法、堿液冷提法、酸浸提法、酶解法和超聲提取法[3]。螺旋藻呈弱堿性，不宜采用酸浸提法，而螺旋藻種類(lèi)和提取方法不同，多糖提取率有很大差異[4-7]。本研究選用麗江程海螺旋藻（屬于鈍頂螺旋藻）為原料，用堿液冷提法提取螺旋藻中的多糖，顯色反應(yīng)進(jìn)行定性檢驗(yàn)，優(yōu)化提取條件，從而確定較佳的提取工藝，以期為程海螺旋藻的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

麗江程海螺旋藻干粉由麗江永程生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供，置于恒溫干燥箱中干燥至恒重備用。

葡萄糖（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、苯酚（廣東光華科技股份有限公司）、硫酸（成都市科龍化工試劑廠）、氫氧化鈉（廣東光華科技股份有限公司）、三氯乙酸（廣東光華化學(xué)廠有限公司）、95%乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、無(wú)水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、丙酮（成都市科龍化工試劑廠），以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

722型光柵分光光度計(jì)（山東高密分析儀器廠）、80-2離心機(jī)（江蘇大地自動(dòng)化儀器廠）、SHZ-S2S循環(huán)水式真空泵（鞏義市大地自動(dòng)化儀器廠）、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0200 g，在燒杯中用蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.2苯酚溶液的配制用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 0 g苯酚，在燒杯中用蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容，配制成5%的苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3.3測(cè)定方法依據(jù)以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照品測(cè)定螺旋藻中多糖的含量，加入苯酚和濃硫酸，使多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，在可見(jiàn)光區(qū)獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

1.3.4螺旋藻中多糖提取率計(jì)算方法

多糖提取率=稀釋倍數(shù)×測(cè)定溶液濃度×容量瓶體積樣品質(zhì)量×100%

將吸光度代入線性回歸方程，計(jì)算提取液濃度，再代入上式計(jì)算螺旋藻中多糖提取率。

2試驗(yàn)與結(jié)果分析

2.1最大吸收波長(zhǎng)的確定

用吸量管分別移取1.00 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、螺旋藻提取液于2支25 mL比色管中，分別加入5%苯酚溶液 1.00 mL，再迅速滴加濃硫酸5.00 mL，混合搖勻，用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度，靜置冷卻至室溫。以試劑空白作對(duì)照，在400～550 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)吸光度，確定最大吸收峰波長(zhǎng)。

吸光度測(cè)定掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。初始階段，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和螺旋藻提取液的吸光度都隨著測(cè)定波長(zhǎng)的增加而增大，當(dāng)波長(zhǎng)增加到490 nm時(shí)兩者都達(dá)到最大吸收峰值，而后隨著波長(zhǎng)增加，吸收峰開(kāi)始減小，因此選擇490 nm為最大吸收波長(zhǎng)，此后的吸光度均在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用吸量管分別移取0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于6支25 mL比色管中，各加入5% 苯酚溶液1.00 mL，再迅速滴加濃硫酸 5.00 mL，混合搖勻，用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度，靜置冷卻至室溫，以第1支比色管為空白對(duì)照，在最大吸收峰波長(zhǎng)處（490 nm）用722型光柵分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程為y=8.862 86x-0.0208 7，相關(guān)系數(shù) r=0.998 6。其中y為吸光度，x為提取液中多糖的濃度。

2.3多糖定性試驗(yàn)

苯酚-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴5%苯酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。endprint

蒽酮-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開(kāi)始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L，多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開(kāi)始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后，多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大，螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

浸提時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后，多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過(guò)程中溶解損失，導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn)，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量，多糖提取率為考察指標(biāo)，考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時(shí)間）。以多糖提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

參考文獻(xiàn)：

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蒽酮-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開(kāi)始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L，多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開(kāi)始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后，多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大，螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

浸提時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后，多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過(guò)程中溶解損失，導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn)，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量，多糖提取率為考察指標(biāo)，考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時(shí)間）。以多糖提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

參考文獻(xiàn)：

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[9]于光，馬宇翔. 鹽澤螺旋藻多糖的最佳獲取條件[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（23）：108-111.呂興萍，楊薇紅，馬春嬌. 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：258-260.endprint

蒽酮-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應(yīng)：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均與多糖類(lèi)化合物顯色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類(lèi)化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗(yàn)結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無(wú)

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對(duì)多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開(kāi)始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度超過(guò)0.4 mol/L，多糖提取率開(kāi)始降低。堿液浸提有助于破壞細(xì)胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過(guò)高則與多糖類(lèi)化合物發(fā)生脫酯反應(yīng)和消去反應(yīng)從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。料液比對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開(kāi)始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當(dāng)料液比超過(guò)1 g ∶25 mL后，多糖提取率開(kāi)始降低。料液比越大，螺旋藻細(xì)胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過(guò)程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過(guò)濾，將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過(guò)夜（進(jìn)行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測(cè)其吸光度，計(jì)算提取液中多糖的提取率。浸提時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

浸提時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h后，多糖提取率開(kāi)始降低。原因可能是隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過(guò)程中溶解損失，導(dǎo)致多糖提取率降低。綜上試驗(yàn)，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時(shí)間。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時(shí)間為變量，多糖提取率為考察指標(biāo)，考察這3個(gè)變量因素對(duì)多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時(shí)間3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對(duì)程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時(shí)間）。以多糖提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)試驗(yàn)條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時(shí)間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學(xué)的研究人員報(bào)道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員報(bào)道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對(duì)較高。

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