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    角喙栓蚤蠅減數(shù)分裂行為觀察

    2014-08-12 04:13:01李翠軍馮典興劉廣純
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年6期
    關(guān)鍵詞:減數(shù)分裂精巢硝酸銀

    李翠軍+馮典興+劉廣純

    摘要:以精巢和卵巢組織為材料,采用空氣干燥制片法,吉姆薩和硝酸銀分別染色,對角喙栓蚤蠅(Dohrniphora cornuta)減數(shù)分裂染色體形態(tài)行為進行研究。結(jié)果表明:角喙栓蚤蠅染色體的二倍體數(shù)目為2n=8,最小的一對染色體著色較深,推測為性染色體,性染色體不存在異型現(xiàn)象。粗線期同源染色體完成配對纏繞在一起,2條性染色體提前完成解螺旋;雙線期分開的同源染色體呈現(xiàn)許多交叉,這些交叉聯(lián)結(jié)是粗線期非姐妹染色體間發(fā)生交換的結(jié)果;后期性染色體呈短棒狀先抵達兩側(cè),證實其為端著絲粒染色體,較常染色體移動速度快。該種減數(shù)分裂過程中未發(fā)現(xiàn)B染色體存在。

    關(guān)鍵詞:角喙栓蚤蠅;精巢;卵巢;減數(shù)分裂;硝酸銀;吉姆薩;染色體

    中圖分類號: Q952.6文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)06-0125-04

    收稿日期:2014-02-17

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31071965,81102296)。

    作者簡介:李翠軍(1986—),女,遼寧朝陽人,碩士,從事細胞遺傳學研究。E-mail:licuijun816@163.com。

    通信作者:劉廣純,教授,從事蚤蠅學研究。E-mail:liugc01@163.com。蚤蠅是雙翅目中較大科之一,是農(nóng)、林、醫(yī)等領(lǐng)域主要害蟲,有些類群在生物防治和法醫(yī)鑒定領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[1]。對蚤蠅染色體結(jié)構(gòu)數(shù)量變異、分裂行為和特殊染色體進行研究,揭示其種類演替、進化和種內(nèi)進化的客觀規(guī)律,可為分類系統(tǒng)建立、近緣種區(qū)分乃至種下分類問題提供新的方法和技術(shù)。目前,已知核型的蚤蠅共6種,分別為蛆癥異蚤蠅(Megaselia scalaris)[2-4]、東亞異蚤蠅(Megaselia spiracularis)[5]、廣東柵蚤蠅(Diplonevra peregrina)[6]、Pseudacteon curvatus、Pseudacteon nocens和Pseudacteon tricuspis[7]。其中,廣東柵蚤蠅二倍體染色體數(shù)目2n=8,性染色體雌雄異型,另外5種蚤蠅的二倍體染色體數(shù)目均為2n=6,不存在明顯的性染色體異型現(xiàn)象。同型染色體種類的性別可能由雄性因子M決定[8-9],或由環(huán)境刺激決定[10]。本試驗以角喙栓蚤蠅(Dohrniphora cornuta)為試材,對其染色體減數(shù)分裂各時期行為特征進行研究,旨在為蚤蠅科系統(tǒng)進化、遺傳防治和分子遺傳學奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    角喙栓蚤蠅由沈陽大學城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點實驗室飼養(yǎng)。

    1.2方法

    1.2.1染色體標本制作參照馮典興等的空氣干燥法[2]。在Ringers液中解剖出蛹期的性腺,移至固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)中固定15~20 min,然后置于滴有少許60%冰醋酸的載玻片上解離10 min左右,用解剖針將材料充分攪碎,滴1滴固定液將細胞打散,放于50 ℃的電熱板上使液體迅速蒸干,染色體充分展開固定在玻片上。

    1.2.2染色體標本染色將上述處理的玻片標本用 1/10吉姆薩染液(pH值6.8)扣染至少30 min,用蒸餾水沖凈玻片表面的染液,置于室溫下無塵處自然干燥。

    1.2.3染色體快速銀染參照Howell等的方法[11]。在 60 ℃ 水浴鍋中避光染色,玻片標本細胞面向上放于有濕濾紙的容器中。在玻片標本有細胞的位置,按2 ∶1的比例滴加50%硝酸銀和明膠顯影液,避光染色5 min左右(玻片呈金黃色為止)。取出立即用溫蒸餾水漂洗染液,小心不要劃掉玻片上的染色體,置于室溫下無塵處自然晾干。

    1.2.4染色體的觀察拍照將干燥好的染色體玻片在 Olympus 相差光學顯微鏡下觀察分析,選取分散良好的分裂相拍照。

    2結(jié)果與分析

    精巢形成初期在解剖鏡下顯示為透明的圓點狀,此時制片得到的結(jié)果中混雜的有絲分裂相較多。當精巢發(fā)育呈橢球形時,有絲分裂相較少,甚至全是精子。因此,選擇精巢從小圓點發(fā)育到近橢球形的時期(23 ℃環(huán)境下7~8 d),可以較容易得到減數(shù)分裂各個時期。同樣情況下雌蛹卵巢制片也可以得到較多的分裂相,但減數(shù)第二次分裂過程較難觀察到,得到的分裂相中大部分為減數(shù)第一次分裂,還有部分有絲分裂相。

    銀染技術(shù)可以使核仁形成區(qū)(NORs)呈特異性著色,還可以用于著絲粒、中心粒、減數(shù)分裂聯(lián)會復合體、性泡和染色體軸的研究。本試驗中4對染色體全部著色但沒有明顯的分帶現(xiàn)象,與基本的吉姆薩染色結(jié)果相似,遂選精巢染色體減數(shù)分裂硝酸銀染色和卵巢染色體減數(shù)分裂吉姆薩染色統(tǒng)一描述。

    細線期:一團染色體細線散于核仁附近(圖1-a、圖2-a),每根細絲是由復制后的2條姐妹色單體組成。細線期完成后各同源染色體聯(lián)會。

    偶線期:染色體線狀縮短變粗(圖1-b、圖2-b)。核仁沒有明顯的形態(tài)變化,同源染色體聯(lián)會,聯(lián)會復合體開始形成,每條線狀染色體實際上包含了4條染色體單體,又稱四合體或四聯(lián)體。此時仍不能分清性染色體和染色體的條數(shù)。

    粗線期:同源染色體已經(jīng)完全配對,常染色體的同源染色體互相緊靠纏繞在一起,呈現(xiàn)3個中間有拐點的長棒狀染色體對和2個短棒狀性染色體。染色體著絲粒位置較集中,染色體臂自著絲粒處向外擺出,2條性染色體獨立存在于著絲粒附近(圖1-c、圖2-c,箭頭所示)。

    雙線期:二價體中同源染色體分開,8條染色體中3對常染色體的同源染色體著絲粒處依然緊靠,染色體臂呈現(xiàn)許多交叉(圖1-d、圖2-d,箭頭所示)。染色體交叉聯(lián)結(jié)在一起的現(xiàn)象,是粗線期非姐妹染色體間發(fā)生交換的結(jié)果。

    終變期:染色體長度、粗細接近中期I染色體,交叉減少,可清晰看到3對常染色體和1對性染色體(圖1-e、圖2-e)。

    中期Ⅰ:染色體聚縮程度最大,常染色體邊緣變光滑,此時依稀可見復制后的姐妹染色單體,16條姐妹染色單體兩兩緊靠在一起,呈現(xiàn)8條狀,染色體整齊排列(圖1-f、圖2-f),箭頭示深染的性染色體。染色體形態(tài)與有絲分裂中期相似。

    后期Ⅰ:同源染色體分向兩側(cè),姐妹染色體單體不再緊靠,常染色體自著絲粒起四臂分開,性染色體呈“八”字形,此時染色體條數(shù)最清晰(圖1-g、圖2-g),性染色體移動較快先抵達兩側(cè)。

    末期Ⅰ:達到兩側(cè)的染色體聚集成堆(圖1-h、圖2-h)。仔細觀察,有的細胞狀結(jié)構(gòu)中能見到?jīng)]有解聚的染色體輪廓,推測為減Ⅱ間期。

    前期Ⅱ:能看到與減Ⅰ粗線期分裂行為相近的染色體,但是此時沒有細胞核結(jié)構(gòu),只見3條長線狀染色體和聚成一團的性染色體(圖1-i),線狀染色體由結(jié)合在一起的姐妹染色單體組成,性染色體聚在一起,不像減Ⅰ粗線期可分清染色體條數(shù)。

    中期Ⅱ:染色體縮短壓縮到最大程度,4對姐妹染色單體排成一排(側(cè)面觀),主溢痕明顯斷裂突出著絲粒端(圖1-j,箭頭所示)。

    后期Ⅱ:姐妹染色體漸漸分開,性染色體較常染色體移動得快,先達到兩側(cè)(如1-k、圖2-i)。

    末期Ⅱ:末期持續(xù)時間較短,卵巢中未能觀察到,只見圓形深染的卵細胞。精巢染色體末期并行達到兩端,聚集成簇,輪廓漸近紡錘形(圖1-l),準備形成精細胞。

    3討論

    角喙栓蚤蠅染色體銀染后,4對染色體全部著色,但沒有明顯的分帶現(xiàn)象。可能的原因是染色體所處時期不利于染色或染色體活潑轉(zhuǎn)錄區(qū)域活性低;或是核仁形成區(qū)較小,難以辨別;再有就是標本制備時表面張力過大,致使銀染物質(zhì)消失。

    減數(shù)第一次分裂中期與有絲分裂中期染色體形態(tài)沒有明顯差別,這與有絲分裂過程存在體細胞配對現(xiàn)象有關(guān);但在減數(shù)第一次分裂后期染色體排列較緊密,同源染色體間緊密程度高于有絲分裂后期。

    減數(shù)分裂一些重要過程主要發(fā)生在第一次分裂中,特別是前期Ⅰ。前期Ⅰ的5個時期持續(xù)時間不同,持續(xù)時間長的容易見到,持續(xù)時間短的就很難觀察到,而且各期持續(xù)時間的長短隨種類的不同而不一樣。這一現(xiàn)象在卡內(nèi)里虱蠅[12]、淡色庫蚊[13]和廣東柵蚤蠅[14]減數(shù)分裂中均有報道。角喙栓蚤蠅前期Ⅰ的偶線期、粗線期、雙線期較常見,細線期和終變期次之。減數(shù)第二次分裂過程持續(xù)時間短,很難觀察到,已有蚤蠅減數(shù)分裂研究中,僅蛆癥異蚤蠅減數(shù)第二次的后期有過報道。本試驗首次對蚤蠅減數(shù)第二次分裂過程進行了較完整觀察。

    粗線期和后期是觀察染色體的最佳時期。在粗線期,可見3條細長的二價體和1對短小的染色體;減數(shù)第二次分裂后期,每側(cè)可見3條“V”形染色體和1條短棒狀染色體。從而證明角喙栓蚤蠅染色體數(shù)2n=8,由3對中著絲粒染色體和1對端著絲粒染色體組成。對角喙栓蚤蠅染色體進行硝酸銀染色顯示,最短的1對染色體著色較深、致密,并且這對染色體分裂行為有別于其他染色體,在粗線期,這對染色體較其他染色體提前分開;在后期Ⅱ,也較其他染色體移動得快,推測其為性染色體。本試驗未能觀察到雌雄個體性染色體間差別,2條性染色體間差別需通過RAPD、熒光原位雜交等技術(shù)近一步研究。在核型已知的蚤蠅中,除了廣東柵蚤蠅性染色體異型外,其他蚤蠅性染色體均不易區(qū)分,可能這種性染色體同型現(xiàn)象在蚤蠅科中較普遍。

    Wolf等相繼報道M. scalaris和M. spiracularis中除3對染色體之外,還存在類著絲粒元件,即B染色體[5,16-18],形態(tài)類似于著絲粒,不具染色體臂。B染色體的數(shù)目在不同物種

    間和同一個體不同細胞間以及減數(shù)分裂和有絲分裂的各個時期都有所不同,導致它們行為的復雜性。在有絲分裂和減數(shù)分裂期間,大多數(shù)B染色體是穩(wěn)定的,并且高度異染色質(zhì)化,通常不與任何A染色體配對,在細胞中隨機分布,數(shù)目變化較大。在減數(shù)分裂時B染色體不分離,具有一定的積累和消減機制。通過對角喙栓蚤蠅減數(shù)分裂觀察,在4對染色體無論聯(lián)會還是染色體分離都正常未受干擾,未發(fā)現(xiàn)B染色體存在。

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