豬病毒性腹瀉檢測基因芯片的兩種樣品標記技術(shù)比較

馬　銳，尹人杰，黃小波，文心田，楊國淋，常曉霞，張　仙，滑　翔，趙玉佳，曹三杰，文翼平，伍　銳

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，豬病研究中心與基因芯片實驗室，成都 611130；2.四川省崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

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豬病毒性腹瀉檢測基因芯片的兩種樣品標記技術(shù)比較

馬銳1#，尹人杰1，2#，黃小波1*，文心田1，楊國淋1，常曉霞1，張仙1，滑翔1，趙玉佳1，曹三杰1，文翼平1，伍銳1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，豬病研究中心與基因芯片實驗室，成都 611130；2.四川省崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

摘要：對豬病毒性腹瀉檢測芯片的兩種樣品標記方法進行比較。分別選取豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S和M基因，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的N和S基因，A型豬輪狀病毒(GAR)的VP7和NSP4基因設(shè)計引物，用PCR擴增制備靶基因，純化后制備豬病毒性腹瀉聯(lián)合檢測基因芯片。提取樣品核酸，采用Cy3直接標記法和間接標記法進行PCR擴增標記，標記的樣品再與芯片雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析，同時對兩種標記方法的特異性、敏感性等進行了比較。結(jié)果表明，兩種方法標記的樣品均能與基因芯片特異性雜交，但直接法的中位信號值(median)均高于間接法的中位信號值，直接法的芯片雜交信噪比是用間接法的5倍以上。兩種標記方法制備樣品特異性好，豬藍耳病毒、豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病毒驗證檢測為陰性；直接法和間接法的最低檢測濃度分別為105和107copies·μL-1，前者的靈敏性是后者的100倍。應用優(yōu)化的直接標記法處理56份臨床樣品，進行芯片的檢測應用，結(jié)果與RT-PCR一致。本研究結(jié)果表明直接法熒光標記樣品可明顯提高病毒性腹瀉檢測芯片的檢測效果。

關(guān)鍵詞：豬腹瀉病毒；基因芯片；直接標記；間接標記；比較

豬流行性腹瀉病(porcine epidemic diarrhea，PED)、豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE) 和A型豬輪狀病毒病(group A porcine rotavirus，GAR) 是分別由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)以及A型豬輪狀病毒(GAR)引起的一類高度接觸性腸道傳染病[1-2]。這三種病的臨床癥狀主要表現(xiàn)為嚴重腹瀉、嘔吐和脫水，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[3]。自1971年在英國發(fā)現(xiàn)PEDV以來，到20世紀90年代已蔓延至整個歐洲，對歐洲養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重后果[4-5]。隨后PEDV傳播至日本[6]、韓國[7-8]、泰國[9]、中國[10]等亞洲國家，并引起腹瀉疾病的暴發(fā)以及豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒病混合感染[11]。2013年后該病在美國、加拿大等國家暴發(fā)豬流行性腹瀉病，造成極大經(jīng)濟損失[12-13]。仔豬病毒性腹瀉檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[14]、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)[15]、間接熒光抗體試驗(IFA)[16]、病毒中和試驗(VNT)[17]、RT-PCR[18]等，但這些技術(shù)無法同時高通量排查多種疾病。基因芯片技術(shù)具有高特異性、高靈敏性、高通量、快速檢測等優(yōu)點，被廣泛應用于基因位點突變分析、基因表達譜分析、疫病診斷和藥物篩選等領(lǐng)域[19-20]。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，基因芯片診斷技術(shù)可以更快、更準確地同時檢測大量樣本[21]。

基因芯片技術(shù)的檢測結(jié)果影響因素很多，其中樣品的處理與標記技術(shù)是影響檢測結(jié)果的重要因素之一。本研究在前期成功構(gòu)建檢測基因芯片的基礎(chǔ)上，結(jié)合豬病毒性腹瀉疫病最新流行態(tài)勢和芯片技術(shù)的研究進展，進行了芯片樣品標記技術(shù)的創(chuàng)新和改進[22]。利用熒光直接標記法(Cy3直接標記在引物上)與熒光間接標記法(Cy3-dCTP)分別對靶基因進行擴增標記，再與構(gòu)建的PEDV-TGEV-GAR的聯(lián)合檢測基因芯片進行雜交，比較兩種方法的雜交效率，為篩選出最佳的樣品標記技術(shù)和提升基因芯片臨床檢測效果奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒

基因重組質(zhì)粒PEDV-S、PEDV-M、TGEV-S、TGEV-N、GAR-VP7、GAR-NSP4均由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心室構(gòu)建保存，對照實驗陽性質(zhì)粒(PRRSV+CSFV+JEV+PCV2)由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心室保存，λ定位基因購自寶生物(大連)生物科技有限公司。

1.2儀器及試劑

基因芯片點樣儀、基因芯片掃描儀均購自北京博奧生物公司；氨基載玻片、點樣緩沖液購自上海百傲生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于美國Omega生物技術(shù)公司；2×TaqPCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒和DNA提取試劑盒購自天根生物公司；Cy3-dCTP購自英國Amersham Biosciences公司。

1.3引物設(shè)計

定位基因引物參考曹三杰等[23]設(shè)計合成。檢測基因引物使用DNAMAN軟件對GenBank中收錄的PEDV、TGEV、GAR、PRRSV、CSFV、JEV以及PCV2基因序列比對分析，用Primer 5.0軟件根據(jù)PEDV的S和M基因、TGEV的S和N基因、GAR的VP7和NSP4基因、PRRSV的NSP2基因、CSFV的Ern基因、JEV的PrM/M基因以及PCV2的ORF2基因的保守區(qū)設(shè)計出長度在200～500 bp、Tm值在55 ℃±2 ℃間的10對引物。每對引物包括一條上游引物及兩條下游引物，并將其中一條下游引物的5′端進行Cy3修飾用于靶基因的標記(表1)。引物均由上海寶生物公司合成。

表1引物信息及基因片段長度

Table 1Information of primers for probe and length of fragment

病毒Viruses目標基因Targetgenes長度/bpLength引物序列(5'-3')SequencesofprimersTGEVN362F:TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA;R:TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT;L:Cy3-TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTTS274F:AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG;R:AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC;L:Cy3-AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGCPEDVS474F:CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG;R:AATTGCTGGTTCCGCTGTAG;L:Cy3-AATTGCTGGTTCCGCTGTAGM421F:CTTATGGCTTGCATCACT;R:GCACTTTCTCGCTATCTG;L:Cy3-GCACTTTCTCGCTATCTGGARVP7381F:TTGAATGAATGGCTATGTAATCC;R:ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT;L:Cy3-ACGCATCATTCTTTCAGTTTGTNSP4270F:GAACAGGTTACTACTAAGGATG;R:TCACATAGACGCAGTTACTTCC;L:Cy3-TCACATAGACGCAGTTACTTCCPositivegeneλ500F:AAAGCGACGCAATGAGGCACT;R:GTTCCACGACCGCAACTGC;L:Cy3-GTTCCACGACCGCAACTGCPRRSVNSP2400F:GGTTCGGAAGAAACTGTCGG;R:GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG;L:Cy3-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGCSFVErn248F:TCAATGGAACCTGAGTGACAAC;R:TATTGTGCCAGTTACACCATCC;L:Cy3-TATTGTGCCAGTTACACCATCCJEVPrM/M451F:CATCAACAACACGGACATTGC;R:AGCGACCAACAGCAGGAG;L:Cy3-AGCGACCAACAGCAGGAGPCV2ORF2494F:CACGGATATTGTAGTCCTGGTCG;R:CCGCACCTTCGGATATACTGTC;L:Cy3-CCGCACCTTCGGATATACTGTC

F.上游引物；R.下游引物；L.標記下游引物

F.Forward primer；R.Reverse primer；L.Labeled primer

1.4探針的制備

復蘇含6種基因的重組質(zhì)粒菌，以試劑盒提取重組質(zhì)粒，稀釋50倍后作為PCR反應模板。PCR反應體系為50 μL：10×PCR Buffer(Mg2+free)5.0 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 4.0 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4.0 μL、特異性的引物對 2.0 μL、質(zhì)粒及定位基因 4.0 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL混勻，去離子水補足50.0 μL進行PCR反應。反應程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠驗證。用乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物進行純化后，作為探針保存在-20 ℃。

1.5芯片的設(shè)計與構(gòu)建

將純化好的探針與點樣緩沖液按1∶1稀釋后加入點樣孔板中，設(shè)置陰性對照為點樣緩沖液。按照設(shè)計的檢測陣列的排布和性能參數(shù)，進行接觸式點樣(圖1)。點樣結(jié)束后置于紫外線下交聯(lián)30 min，再于80 ℃烘烤2 h，密封于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1　基因芯片矩陣設(shè)計Fig.1　The design of DNA microarray spotting

1.6兩種熒光標記方法標記靶基因

為確定最佳標記方式，本研究對比使用Cy3直接引物標記法和間接C堿基標記法，最后將得到的靶基因進行芯片雜交，通過掃描分析數(shù)據(jù)，確定靶基因標記方式。

1.6.1直接引物標記以PEDV-M、PEDV-S、TGEV-N、TGEV-S、GAR-NSP4、GAR-VP7陽性質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。50 μL反應體系如下：10×PCR Buffer(Free Mg2+) 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTP Mixture(10.0 mmol·L-1)4.0 μL，5′端標記有Cy3的反向引物1.0 μL，非熒光正向引物1.0 μL，模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μl，去離子水32.0 μL。反應程序：94 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。反應完畢，各取6 μL靶基因產(chǎn)物以2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。1.6.2間接C堿基標記同樣以6種陽性質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。50 μL反應體系如下： 10×PCR Buffer(Free Mg2+) 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTP Mixture(10.0 mmol·L-1)4.0 μL，不含熒光的上下游引物對2.0 μL，模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL，去離子水31.5 μL，并在反應體系中加入終濃度為0.25 mmol·L-1的CY3-dCTP 0.5 μL。擴增體系條件與“1.6.1”相同。反應完畢，各取6 μL靶基因進行電泳分析。

1.7芯片雜交與結(jié)果判定

分別將直接標記法和間接標記法標記好的靶基因與雜交緩沖液以1∶1的比例混合，于95 ℃變性3 min，放冰上冷卻。在每個陣列上滴加50 μL靶基因產(chǎn)物混合液，用圍欄固定后放入雜交盒。在48 ℃與芯片雜交3 h，取出芯片，按洗液1(2×SSC+0.1%SDS)、洗液2(0.5×SSC+0.05%SDS)、洗液3(0.2×SSC)、洗液4(雙蒸水)的順序依次洗滌5 min。離心干燥后進行掃描分析。

掃描儀開通綠色532 nm熒光單通道，以9個點信號中位值(median)以及其與背景信號平均值的比值(SNRm)為判定依據(jù)。當median≥1 000、SNRm值≥2，陽性對照和陰性對照均成立；掃描出的各個點陽性清晰可見，四者結(jié)果一致可以判定為雜交結(jié)果成立。

1.8兩種標記法的芯片特異性比較

提取PEDV、TGEV、GAR、PRRSV、CSFV、JEV以及PCV2基因的陽性質(zhì)粒為模板，分別用直接標記法和間接標記法進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物與制備好的芯片雜交，掃描并分析結(jié)果，以驗證基因芯片的特異性。

1.9兩種標記法的芯片靈敏性比較

測定各質(zhì)粒常規(guī)PCR膠回收產(chǎn)物的OD260 nm，換算成DNA的拷貝數(shù)，其濃度分別為PEDV-M(1.29×1011copies·μL-1)、PEDV-S(1.15×1011copies·μL-1)、TGEV-N(1.26×1011copies·μL-1)、TGEV-S(1.22×1011copies·μL-1)、GAR-NSP4(1.39×1011copies·μL-1)以及GAR-VP7(1.46×1011copies·μL-1)。作101～109倍比稀釋后，分別用直接標記法和間接標記法進行熒光標記，與制備的共檢芯片雜交，以評價該共檢芯片的靈敏性。

1.10直接標記法芯片的重復性試驗

同批次芯片的重復性：選取PM(1.29×1010copies·μL-1)和PS(1.15×109copies·μL-1)靶基因用不對稱RT-PCR直接標記產(chǎn)物，取同批次基因芯片5張分別與其雜交。評價該共檢芯片的穩(wěn)定性。

單張芯片的重復性：取一張制備好的芯片進行雜交，掃描分析后，將該芯片變性消除雜交斑點，立即將該芯片再次進行下一次雜交，繼續(xù)掃描分析，如此重復8次。從而獲得一張芯片的最高檢測上限。

1.11熒光直接標記法的臨床應用評價

收集來自四川省綿陽、阿壩茂縣、彭州、資陽安岳、眉山、廣安、攀枝花、巴中通江地區(qū)的56份送檢小腸病料，所有小腸病料均來自有腹瀉癥狀且30 d以下的仔豬。小腸病料經(jīng)研磨后，轉(zhuǎn)入超凈臺。嚴格按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA后，以RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，反轉(zhuǎn)錄總體系為10 μL，反應體系如下： 5×Prime Script Buffer 2.0 μL，Prime Script RT Enzyme Mix (25 mmol·L-1)0.5 μL，Random 6 mers(10.0 mmol·L-1)0.5 μL，模板RNA 2.0 μL，RNAse Free ddH2O 5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應程序：37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃保存cDNA。通過直接標記法進行靶基因擴增，與共檢芯片雜交，掃描分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1引物特異性驗證

將“1.4”中未純化的PCR產(chǎn)物電泳鑒定。結(jié)果可見三種病毒的擴增目的基因片段與預期大小一致：PEDV-M:421 bp、PEDV-S:474 bp、TGEV-N:362 bp、TGEV-S:276 bp、GAR-NSP4:270 bp、GAR-VP7:381 bp(圖2)，可見引物特異性好。

2.2靶基因標記方法比較

基因雜交結(jié)果表明，使用Cy3引物直接標記法獲得的掃描參數(shù)，通過肉眼直觀判斷，可見其優(yōu)于Cy3-dCTP間接標記方法(圖3)。兩種不同的標記方法并沒有影響芯片雜交的背景值，但使用Cy3引物直接標記法獲得的中位值比使用Cy3-dCTP間接

標記方法高7 000以上；比較SNR值，前者是后者的5倍以上，因此選用5′端標記有Cy3的反向引物作為靶基因的標記方式可提高芯片雜交效率(表2)。

M.100 bp ladder DNA 相對分子質(zhì)量標準；1.PEDV-M；2.PEDV-S；3.TGEV-N；4.TGEV-S；5.GAR-NSP4；6.GAR-VP7；7.陰性對照M.100 bp ladder DNA marker；1.PEDV-M；2.PEDV-S；3.TGEV-N；4.TGEV-S；5.GAR-NSP4；6.GAR-VP7；7.Negative control圖2　目的基因的PCR擴增Fig.2　The PCR amplification results of target gene

圖3　不同標記方法的雜交結(jié)果Fig.3　Scan results of different labeling method

2.3兩種標記法的特異性

試驗結(jié)果表明：分別用直接標記法與間接標記法標記的芯片，對GAR、TGEV、PEDV單獨檢測時在陣列設(shè)置的相應位置都出現(xiàn)了肉眼可見雜交斑點，且無明顯的非特異性雜交情況出現(xiàn)。對PRRSV+CSFV+JEV+PCV2陽性質(zhì)粒檢測結(jié)果均為陰性。兩者結(jié)合表明兩種標記方法應用于共檢芯片都具有高特異性(圖4)。

2.4兩種標記法芯片的靈敏性

結(jié)果表明(圖5)：用直接標記法，PEDV-M探針、PEDV-S探針、TGEV-N探針、TGEV-S、GAR-NSP4以及GAR-VP7探針檢測的最低濃度分別為1.29×105、1.15×105、1.26×105、1.22×105、1.39×105以及1.46×105copies·μL-1。綜上所述，使用直接標記法，該檢測芯片的最低檢測濃度為105copies·μL-1。同理，使用間接標記 Indirect-labeling法與稀釋的探針雜交，6種探針的最低濃度分別為1.29×107、1.15×107、1.26×107、1.22×107、1.39×107、1.46×107copies·μL-1。使用間接標記法與探針雜交，最低檢測濃度為107copies·μL-1。

表2不同標記方法的雜交信號

Table 2Signal intensity of different labeling method by asymmetric PCR

檢測基因Genesdetected標記方式Labelingmethods中位值Median背景值BackgroundSNRmPEDV-M間接標記Indirect-labeling16033214.99直接標記Direct-labeling960533628.59PEDV-S間接標記Indirect-labeling16603325.00直接標記Direct-labeling936131629.62TGEV-N間接標記Indirect-labeling16433334.93直接標記Direct-labeling978731231.37TGEV-S間接標記Indirect-labeling15323424.48直接標記Direct-labeling934032628.65NSP4間接標記Indirect-labeling16063195.03直接標記Direct-labeling944532728.89VP7間接標記Indirect-labeling15903155.05直接標記Direct-labeling968933129.27

2.5直接標記法芯片的重復性試驗

同批次芯片的重復性：選取PM(1.29×1010copies·μL-1)和PS(1.15×109copies·μL-1)靶基因用不對稱RT-PCR直接標記，與同批次基因芯片5張雜交。其中PM探針雜交信號中位值為8 801.80±492.58，變異系數(shù)為5.58%，SNR值為22.12±1.21，變異系數(shù)為5.47%。PS探針雜交信號中位值為8 949.60±584.13，變異系數(shù)為6.52%，SNR值為22.09±1.57，變異系數(shù)為7.10%。結(jié)果表明雜交信號穩(wěn)定性良好(圖6)。

單張芯片的重復性：單張芯片最多可重復利用7次，在第八次時SNRm值均小于2.0(圖7)。

2.6直接標記法的臨床應用

共檢芯片檢測結(jié)果表明(表3)三種病毒在西南地區(qū)豬群中普遍以PEDV單獨感染為主?；旌细腥緝H有PEDV+GAR 2例，TGEV的單純感染有4例。與PCR檢測對比，符合率為100%，利用直接標記法可以有效提高芯片的檢測質(zhì)量。

3討論

基因芯片技術(shù)自M.Schena等[24]1995年首次報道以來，因其具有高通量平行檢測多個病原體基因、高準確度和高靈敏性等特點受到廣泛關(guān)注。作為一種新型的檢測方法，已被用于識別和診斷病原體，環(huán)境微生物和臨床樣本等[25]。然而影響基因芯片雜交效果的因素很多，其中樣品的標記技術(shù)是重要因素之一。本研究分別將直接標記法和間接標記法應用于基因芯片雜交檢測，對兩種熒光標記方法進行了對比。結(jié)果表明直接標記法可顯著提高芯片雜交效率。

靶基因標記的常用方法為間接標記法和直接標記法兩種。一種為擴增時摻入熒光標記的三磷酸脫氧核糖核苷酸(間接標記)；另一種為引物的5′端加入熒光修飾基團后進行擴增(直接標記)。直接標記靶基因的優(yōu)點在于其可在引物結(jié)合階段進行標記，過程省時省力且無需更多優(yōu)化[26-27]。而間接標記法不但需要消耗大量時間來制作鏈接標記物，還需要對所摻入的熒光標記物進行濃度、溫度等優(yōu)化[28-29]。目前常用于生物芯片的標記物主要包括：放射性同位素標記、生物素標記和熒光染料標記。由于放射性同位素對實驗人員的危害過于嚴重，現(xiàn)在基本淘汰使用。生物素可同時標記在玻片載體和膜載體上，因其不需要避光等優(yōu)點，常被用于可視化芯片檢測[30-31]。熒光標記主要適用于玻片載體上，可有效提高SNR值。常用的熒光標記物分為Cy3和Cy5，兩種標記物可單一使用，也可使用雙通道掃描[32]。因為Cy3在結(jié)構(gòu)上比Cy5少兩個次甲基組，所以在標記反應中消耗更少的能量。其次Cy5對空氣中的O3比較敏感，使得暴露在空氣中的Cy5易被其破壞，造成實驗誤差[33]。

圖4　特異性試驗雜交結(jié)果Fig.4　The hybridization result of specific experiment

A～C.使用直接標記法與芯片雜交；D～F.使用間接標記法與芯片雜交A-C.Direct-labeling method;D-F.Indirect-labeling method圖5　靈敏性試驗雜交結(jié)果Fig.5　The hybridization result of sensitivity experiment

圖6　不同批次芯片重復利用熒光信號掃描結(jié)果Fig.6　Scan result of fluorescence intensity of different batch microarray repeatedly used

圖7　單張芯片重復利用熒光信號掃描結(jié)果Fig.7　Scan result of fluorescence intensity of single microarray repeatedly used

表356份樣品的檢測結(jié)果

Table 3The detection result of 56 samples

感染類型InfectiontypeRT-PCR(X)共檢芯片(Y)Microarray(Y)X與Y的符合率/%TheaccuracyofXandY芯片檢測感染率/%MicroarraydetectionratePEDV38/5638/5610067.8TGEV4/564/561007.1PEDV+GAR2/562/561003.6PEDV、TGEV、PEDV+GAR44/5644/5610078.6

本試驗采用Cy3作為標記的熒光素，分別使用直接標記法與間接標記法對靶基因進行標記。特異性試驗和靈敏性試驗結(jié)果表示，兩種標記方法都有良好特異性，然而直接標記法靈敏性較間接標記法高100倍。分析原因認為，Cy3-dCTP間接標記中的C鍵本身對C堿基具有很強的位阻作用，使得靶基因在PCR擴增反應效率降低，不利于靶基因產(chǎn)物量的增加和Cy3對靶基因的標記；同時，間接標記在PCR反應中的摻入濃度需要反復摸索條件，且在PCR反應中需要單獨摻入一定量dCTP引導Cy3-dCTP擴增標記，增加了生產(chǎn)成本；其次間接標記本身只標記的是靶基因產(chǎn)物中的C堿基，因此對于引物設(shè)計時擴增產(chǎn)物中C堿基占有的比重與雜交效率也有一定影響，靶基因產(chǎn)物中C堿基的含量決定了Cy3標記上的量的多少?；谶@兩點使得間接標記的靶基因雜交后信號值大大低于Cy3直接引物標記。而在引物5′端引入Cy3標記能消除上述兩種不利影響，且在試驗成本上兩種方法大體一致，因此本試驗采用Cy3引物直接標記法大大增強了芯片雜交效率。

本研究利用已知陽性質(zhì)粒對基因芯片的制備進行了特異性、靈敏性及重復性評價試驗。試驗結(jié)果顯示，該芯片對TGEV、PEDV、GAR有高特異性，且不與PRRSV、CSFV、JEV、PCV2發(fā)生反應。5個不同批次制備的芯片與陽性質(zhì)粒進行雜交，信號結(jié)果差異性小，檢測結(jié)果再現(xiàn)度高；同一張芯片可重復檢測7次，穩(wěn)定性好。應用該芯片進行56份臨床樣本檢測，與RT-PCR結(jié)果一致，再次證明該芯片特異性高，穩(wěn)定性好。

本研究在比較了兩種標記方法的基礎(chǔ)上，進一步應用直接標記法進行了臨床樣品的驗證，檢測其實用性。檢測結(jié)果顯示(表3)：RT-PCR檢測結(jié)果顯示56份樣品中RT-PCR與共檢芯片顯示陽性感染率同為78.6%，兩者符合率為100%。與健康豬相比，病毒性腹瀉病的感染率為78.6%，與Q.Zhang等文章[34]中所列出的中國豬腹瀉病感染率相一致，低于R.Q.Sun等報道[35]中所說的82%。56份臨床檢測樣品，其中67.8%為PEDV單獨感染，與Q.Zhang等[34]所報道的PEDV感染率相同，高于捷克斯諾伐克(18.8%)和韓國(50.4%)[36-37]。結(jié)果表明，應用直接標記法可有效提高芯片雜交效率。

參考文獻(References)：

[1]BOWMAN A S，KROGWOLD R A，PRICE T，et al.Investigating the introduction of porcine epidemic diarrhea virus into an Ohio swine operation[J].BMCVetRes，2015，11：38.

[2]WANG L，ZHANG Y，BYRUM B.Development and evaluation of a duplex real-time RT-PCR for detection and differentiation of virulent and variant strains of porcine epidemic diarrhea viruses from the United States[J].JVirolMethods，2014，207：154-157.

[3]KIM S Y，SONG D S，PARK B K.Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR[J].JVetDiagnInvest，2001，13(6)：516-520.

[4]PENSAERT M B，DE BOUCK P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].ArchVirol，1978，58(3)：243-247.

[5]VAN REETH K，PENSAERT M.Prevalence of infections with enzootic respiratory and enteric viruses in feeder pigs entering fattening herds[J].VetRec，1994，135(25)：594-597.

[6]TAKAHASHI K，OKADA K，OHSHIMA K.An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan[J].NihonJuigakuZasshi，1983，45(6)：829-832.

[7]PARK S J，KIM H K，SONG D S，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field isolates in Korea[J].ArchVirol，2011，156(4)：577-585.

[8]LEE S，LEE C.Outbreak-related porcine epidemic diarrhea virus strains similar to US strains，South Korea，2013[J].EmergInfectDis，2014，20(7)：1223-1226.

[9]PURANAVEJA S，POOLPERM P，LERTWATCHARASARAKUL P，et al.Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus，Thailand[J].EmergInfectDis，2009，15(7)：1112-1115.

[10]CHEN J，WANG C，SHI H，et al.Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J].ArchVirol，2010，155(9)：1471-1476.

[11]ZHANG Q，HU R，TANG X，et al.Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J].ArchVirol，2013，158(8)：1631-1636.

[12]CHEN Q，LI G，STASKO J，et al.Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J].JClinMicrobiol，2014，52(1)：234-243.

[13]JUNG K，SAIF L J.Porcine epidemic diarrhea virus infection：Etiology，epidemiology，pathogenesis and immunoprophylaxis[J].VetJ，2015，204(2)：134-143.

[14]GERBER P F，GONG Q，HUANG Y W，et al.Detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus in serum and colostrum by indirect ELISA[J].VetJ，2014，202(1)：33-36.

[15]SONG D，PARK B.Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines[J].VirusGenes，2012，44(2)：167-175.

[16]OPRIESSNIG T，XIAO C T，GERBER P F，et al.Porcine epidemic diarrhea virus RNA present in commercial spray-dried porcine plasma is not infectious to na?ve pigs[J].PLoSOne，2014，9(8)：e104766.

[18]ENGEL E A，ESCOBAR P F，ROJAS L A，et al.A diagnostic oligonucleotide microarray for simultaneous detection of grapevine viruses[J].JVirolMethods，2010，163(2)：445-451.

[19]TOWNSEND M B，DAWSON E D，MEHLMANN M，et al.Experimental evaluation of the FluChip diagnostic microarray for influenza virus surveillance[J].JClinMicrobiol，2006，44(8)：2863-2871.

[20]LUO Y，DU J，ZHAN Z，et al.A diagnostic gene chip for hereditary spastic paraplegias[J].BrainResBull，2013，97：112-118.

[21]LIU Y C，HUANG G S，WU M C，et al.Detection of foot and mouth disease and porcine reproductive and respiratory syndrome viral genes using microarray chip[J].VetResCommun，2006，30(2)：191-204.

[22]曹三杰，黃小波，文心田，等.豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)學報，2009，29(2)：121-124.

CAO S J，HUANG X B，WEN X T，et al.Construction of detecting genechip for transmissible gastroenteritis virus[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2009，29(2)：121-124.(in Chinese)

[23]曹三杰，文心田，肖馳，等.應用基因芯片技術(shù)檢測禽 4 種主要疫病的研究檢測基因芯片的構(gòu)建及制備[J].中國獸醫(yī)學報，2007，27(3)：311-314，318.

CAO S J，WEN X T，XIAO C，et al.Detection of four avian infectious diseases using microarray technology Ⅱ.Construction and preparation of detection microarray[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2007，27(3):311-314，318.(in Chinese)

[24]SCHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)：467-470.

[25]KNAUER M，IVLEVA N P，NIESSNER R，et al.A flow-through microarray cell for the online SERS detection of antibody-capturedE.colibacteria[J].AnalBioanalChem，2012，402(8)：2663-2667.

[26]KIM Y K，LIM S I，CHO Y Y，et al.The CSFV DNAChip：a novel diagnostic assay for classical swine fever virus[J].JVirolMethods，2014，204：44-48.

[27]BANéR J，GYARMATI P，YACOUB A，et al.Microarray-based molecular detection of foot-and-mouth disease，vesicular stomatitis and swine vesicular disease viruses，using padlock probes[J].JVirolMethods，2007，143(2)：200-206.

[28]LUNG O，F(xiàn)ISHER M，BEESTON A，et al.Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses[J].JVirolMethods，2011，175(2)：236-245.

[29]LI X，QI X，MIAO L，et al.Detection and subtyping of influenza A virus based on a short oligonucleotide microarray[J].DiagnMicrobiolInfectDis，2009，65(3)：261-270.

[30]CAO X，WANG Y F，ZHANG C F，et al.Visual DNA microarrays for simultaneous detection of Ureaplasma urealyticum and Chlamydia trachomatis coupled with multiplex asymmetrical PCR[J].BiosensBioelectron，2006，22(3)：393-398.

[31]HE Y，ZHANG X，ZHANG S，et al.Visual detection of single-base mismatches in DNA using hairpin oligonucleotide with double-target DNA binding sequences and gold nanoparticles[J].BiosensBioelectron，2012，34(1)：37-43.

[32]HEGDE P，QI R，ABERNATHY K，et al.A concise guide to cDNA microarray analysis[J].Biotechniques，2000，29(3):548-550.

[33]MOREIRA B G，YOU Y，OWCZARZY R.Cy3 and Cy5 dyes attached to oligonucleotide terminus stabilize DNA duplexes：Predictive thermodynamic model[J].BiophysChem，2015，198：36-44.

[34]ZHANG Q，HU R，TANG X，et al.Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J].ArchVirol，2013，158(8)：1631-1636.

[35]SUN R Q，CAI R J，CHEN Y Q，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J].EmergInfectDis，2012，18(1)：161-163.

[37]CHAE C，KIM O，CHOI C，et al.Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs[J].VetRec，2000，147(21)：606-608.

(編輯白永平)

Comparision of Two Fluorescence-labeling Methods of Porcine Diarrheal Viruses Detection Microarrays

MA Rui1#，YIN Ren-jie1，2#，HUANG Xiao-bo1*，WEN Xin-tian1，YANG Guo-lin1，CHANG Xiao-xia1，ZHANG Xian1，HUA Xiang1，ZHAO Yu-jia1，CAO San-jie1，WEN Yi-ping1，WU Rui1

(1.PorcineDiseaseResearchCenterandMicroarrayLaboratory，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.InstituteofRuralDevelopmenofChongzhou，Chongzhou611200,China)

Abstract:Two samples labeling methods of microarray detection for diarrheal viruses are compared respectively in this study.Primers were designed based on the sequences ofSandMgene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)，SandNgene of Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV)，VP7 andNSP4 gene of Group A Porcine Rotavirus(GAR)，and then were used to amplify the target genes by PCR.The target genes were purified using ethanol precipitation to manufacture simultaneous detection microarray.Fluorescence molecules were imported to PCR products by direct-labeling method and indirect-labeling method respectively after extraction of virus RNA from samples.The specificity and sensitivity of two labeling methods were compared by scanning and analyzing the results after PCR products hybridized with microarray.The results showed that microarray based on two different labeling methods could both hybridize with target genes with high specificity.However，the median signal volumes of direct-labeling were higher than those of indirect-labeling and Signal to Noise Ratio(SNR) of direct-labeling was more than five times higher compared with that of indirect-labeling.Specific test results showed that two labeling methods were both specific and CSFV，PRRSV，PCV-2，JEV detection showed negative result.Sensitivity test results suggested that the sensitivity of direct-labeling were 100 times higher than that of indirect-labeling.The minimum concentration of direct-labeling method and indirect-labeling method can be detected reliably were 105copies·μL-1and 107copies·μL-1，respectively.A total of 56 clinical samples were treated with direct-labeling and hybridized with the microarray，the results were consistent with those of RT-PCR.This study indicate that direct-labeling technology could effectively improve the detection effect of diarrhea microarray.

Key words:porcine diarrhea virus；microarray；direct-labeling；indirect-labeling；comparison

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.015

收稿日期：2015-08-10

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201203056)

作者簡介：馬銳(1989-)，男，四川成都人，碩士生，主要從事動物傳染病研究，E-mail：iwanttogetsci@163.com；尹人杰(1989-)，為本文共同第一作者 *通信作者：黃小波，教授，E-mail：rsghb110@126.com

中圖分類號：S854.43

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0752-10