豇豆輪紋病病菌產(chǎn)毒條件篩選及毒素活性測定

劉志恒，李健冰，安 心，李 蔚，曹友文，王君赫

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866； 2.彰武縣植保站，阜新 123200)

豇豆輪紋病病菌產(chǎn)毒條件篩選及毒素活性測定

劉志恒1*，李健冰1，安 心1，李 蔚1，曹友文2，王君赫1

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866； 2.彰武縣植保站，阜新 123200)

采用種子萌發(fā)抑制率和種子胚芽抑制率的檢測方法，研究了豇豆輪紋病病原菌(Corynesporacassiicola)在不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH、光照和振蕩條件下粗毒素的產(chǎn)生及其活性。試驗結(jié)果表明：不同的培養(yǎng)條件下病原菌產(chǎn)生毒素活性不同，查彼培養(yǎng)液為最佳培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)可以促進毒素的產(chǎn)生，最適的產(chǎn)毒pH為7～8，最適溫度為20～25 ℃，最佳培養(yǎng)時間為15 d，光照條件下病原菌粗毒素的活性最大。豇豆輪紋病粗毒素對于不同寄主的活性測定結(jié)果表明：豇豆輪紋病菌毒素接種的10種供試植物中，大豆、菜豆致病反應(yīng)明顯，相對的病斑較大，而對黃瓜無致病力，不產(chǎn)生病斑。

豇豆輪紋??； 多主棒孢菌； 毒素； 活性

豇豆作為遼寧的主要蔬菜作物之一，隨著栽培面積的擴大和栽培年限的增加，病害的種類和病原菌的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，出現(xiàn)了一些新病害。2011年8月作者在遼寧省新民市調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種新病害，該病害主要危害豇豆葉片，嚴重時也危害豆莢，病害蔓延迅速并且危害嚴重，在7-8月危害最重，病葉率達到60%以上，給豇豆生產(chǎn)造成了很大損失。作者通過病害癥狀描述、病原菌形態(tài)鑒定及分子序列比對，并經(jīng)柯赫氏法則證病，證明豇豆上新見病害——輪紋病的病原菌為真菌多主棒孢(Corynesporacassiicola)。

長期以來，種植抗病品種和施用化學農(nóng)藥在防治真菌病害中發(fā)揮了巨大作用，但由于多數(shù)病原真菌容易發(fā)生遺傳變異，因此，出現(xiàn)抗性菌株的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，并且高劑量的施用化學農(nóng)藥勢必會影響環(huán)境及食品的安全性。病菌致病粗毒素在適當?shù)倪x擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體[1]，病原菌的產(chǎn)毒能力與培養(yǎng)基類型和環(huán)境條件密切相關(guān)[2]。為了明確毒素在病程中的作用和應(yīng)用粗毒素進行細胞突變體篩選，首先需要培養(yǎng)出大量的病菌粗毒素。然而對于豇豆輪紋病病原菌的毒素培養(yǎng)條件迄今未見報道。

本研究在分離豇豆輪紋病的基礎(chǔ)上，初步探討了豇豆輪紋病菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)條件,以期為豇豆輪紋病的相關(guān)研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物選用9種：豇豆、菜豆、大豆、花生、茄子、辣椒、絲瓜、黃瓜和西葫蘆。采用市售幼苗用于試驗。

1.2 病原菌分離及毒素的提取

2011-2012年，于遼寧省新民市露地栽培豇豆采集具有典型特征的輪紋病葉片，采用常規(guī)組織分離方法[3]進行病原菌分離和純化，并經(jīng)單孢分離獲得病菌純培養(yǎng)備用。

采用常規(guī)方法培養(yǎng)獲取病菌毒素。將供試菌株于PDA平板培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)，用打孔器打取約0.5 cm的菌餅4塊，置于下述供試液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。將不同條件培養(yǎng)獲得的病菌培養(yǎng)液用8層無菌紗布過濾，然后濾液用濾紙抽濾，得到無菌濾液。將無菌濾液經(jīng)8 000r/min離心10min，取得上清液即為病原菌粗毒素[4]。將所得的粗毒素接種于供試豇豆種子上，置于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)36h，計測種子萌發(fā)率及胚芽長度。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌粗毒素產(chǎn)生條件的篩選

培養(yǎng)液的篩選。試驗選用以下5種培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH均為7。

(1)PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200g，葡萄糖12 g，蒸餾水1000mL。

(2)PS培養(yǎng)液：馬鈴薯200g，蔗糖12 g，蒸餾水1000mL。

(3)Fries培養(yǎng)液：酒石酸銨5 g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，酵母浸膏 1.0g，蔗糖30g，蒸餾水1000mL。

(4)Czapek培養(yǎng)液：NaNO32 g，K2HPO41g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01g，蔗糖 30g，蒸餾水 1000mL。

(5)Richard培養(yǎng)液：KNO310g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，F(xiàn)eCl30.02 g，蔗糖 50g，蒸餾水1000mL。

培養(yǎng)時間篩選。設(shè)置3、6、9、12、15、18、21、24 d計8個處理時間。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液(前述預備試驗后選定)三角瓶中，于25 ℃、黑暗條件、120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。分別于不同時間取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復。

培養(yǎng)pH篩選。設(shè)置pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8個梯度處理。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中，培養(yǎng)溫度25 ℃，15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復。

培養(yǎng)溫度篩選。設(shè)置溫度為5、10、15、20、25、30、35 ℃計7個培養(yǎng)溫度處理。將直徑為0.5 cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中分別培養(yǎng)，15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復。

培養(yǎng)光照條件篩選。選擇3種條件：24 h光照、24 h黑暗、12 h光照和12 h黑暗交替。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液中，于25 ℃、120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復3次。

振蕩條件篩選。設(shè)置24 h振蕩、24 h靜置、12 h靜置12 h振蕩3種條件。將直徑0.5 cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中，25 ℃、黑暗、120r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15 d后取樣制備豇豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復3次。

1.3.2 病原菌粗毒素活性的測定

葉片測定法。豇豆植株上的健康葉片用無菌水洗凈，采用針刺法將蘸有1mL粗毒素的脫脂棉放入傷口上，25 ℃光照保濕培養(yǎng)，3d后觀察葉片處理部位的病變情況。以空白培養(yǎng)液為對照。

幼苗浸漬法。取大約8 cm株高的豇豆幼苗，放入裝有5 mL豇豆輪紋病粗毒素的試管內(nèi)培養(yǎng)，觀察幼苗生長情況，以空白培養(yǎng)液為對照。

不同植物敏感性測定。播種茄子、番茄、花生、大豆等作物，待作物4～6片葉時，采用針刺法,以蘸有豇豆輪紋病病菌粗毒素的脫脂棉接種供試植株葉片上，保濕培養(yǎng)觀察葉片針刺部位發(fā)病情況，測量病斑直徑大小。以空白培養(yǎng)液為對照。

1.3.3 粗毒素的生物活性測定

取粗毒液5 mL注入培養(yǎng)皿中作為種子萌發(fā)培養(yǎng)液，每皿放入20粒豇豆種子。重復5次。置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)36h，計測豇豆種子萌發(fā)數(shù)及胚芽長度，計算萌發(fā)率和胚芽抑制率。

胚芽生長抑制率(%) =

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個處理重復5次，所得數(shù)據(jù)用SPSS和Excel軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對病原菌毒素產(chǎn)生的影響

不同的培養(yǎng)基病原菌毒素的產(chǎn)生量不同，在查彼培養(yǎng)液中的產(chǎn)生量最大，種子萌發(fā)抑制率及胚芽抑制率均達到80%以上，其次為Fries培養(yǎng)液，產(chǎn)生粗毒素最少的為PD培養(yǎng)液(表1)。

表1病菌在不同培養(yǎng)液產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響1)

Table1Effectofcrudetoxinunderdifferentculturemediaontheinhibitoryrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth

培養(yǎng)液Culturemedia種子萌發(fā)抑制率/%Inhibitionrateofseedgermination胚芽生長抑制率/%Inhibitionrateofgermgrowth PD28．89e18．95f PS41．11d35．73e Rich45．56d54．57d Fries70．00c70．66c Czapek83．33b81．18b CK98．00a98．00a

1) 根據(jù)Duncan分析，同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示數(shù)據(jù)間無顯著性差異(P=0.05)。 Within the same column,the means with the same lowercase letters indicate no significant difference atP=0.05 according to Duncan’s analysis of variance.

不同培養(yǎng)時間對病原菌粗毒素的影響見圖1。在培養(yǎng)3～15 d之間，隨著時間的延長，種子萌發(fā)、胚芽生長抑制率逐漸變大并且從圖中可知曲線的斜率較大，因此毒素的產(chǎn)生與培養(yǎng)時間具有一定的正相關(guān)。在15 d時無論種子萌發(fā)抑制率還是胚芽生長抑制率均達到80%以上；在15～21d時，病原菌粗毒素隨著時間的延長種子萌發(fā)及胚芽生長抑制率均下降。據(jù)此認為，病原菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)時間為15 d。

不同pH對病原菌粗毒素的影響根據(jù)圖2結(jié)果可知，豇豆輪紋病病原菌在pH 2～9之間均可產(chǎn)生毒素。在pH 2～8間，病原菌粗毒素的產(chǎn)生量隨pH值的增加而增加。在pH 8時，抑制率最大，種子萌發(fā)抑制率71.35%，胚芽生長抑制率72.68%。當pH為9時，抑制率下降為50%以下。據(jù)此確定病原菌產(chǎn)毒最佳pH為 8。

圖1 病菌在不同時間產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.1 Effect of crude toxin under different culture time on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

圖2 病菌在不同pH產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.2 Effect of crude toxin under different pH values on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同溫度對病原菌粗毒素的影響見圖3。由圖3可知，病原菌粗毒素在5～35 ℃之間均可產(chǎn)生，對種子萌發(fā)及胚芽的抑制率隨著溫度的升高逐漸增高。在25 ℃時種子萌發(fā)抑制率達到最大為72.22%，胚芽生長抑制率為62.33%；而其后隨著溫度的升高抑制率逐漸降低，在35 ℃時種子萌發(fā)抑制率僅為28.89%，胚芽生長抑制率為38.36%。由此可知，豇豆輪紋病菌粗毒素在25 ℃時產(chǎn)生量最大。

不同光照對病原菌粗毒素的影響見圖4。由圖4可知，光照條件下種子萌發(fā)抑制率達63.33%，胚芽生長抑制率為65.75%；而黑暗條件下種子萌發(fā)抑制率為48.89%，胚芽生長抑制率為49.32%。表明光照條件有利于病原菌粗毒素的產(chǎn)生。

圖3 病菌在不同溫度條件下產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.3 Effect of crude toxin under different temperatures on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

圖4 病菌在不同光照條件下產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.4 Effect of crude toxin under different light conditions on the inhibition rate of cowpea seed germination and germ growth

不同振蕩條件對病原菌粗毒素的影響測定結(jié)果見圖5。不同振蕩條件對病原菌粗毒素的產(chǎn)生影響不同。間歇振蕩利于病原菌粗毒素產(chǎn)生，種子萌發(fā)抑制率達74.44%，胚芽生長抑制率為70.55%；而靜止培養(yǎng)下抑制率僅為40%。因此間歇振蕩培養(yǎng)利于病原菌粗毒素產(chǎn)生。

2.2 病原菌毒素活性測定結(jié)果

針刺豇豆葉片接種粗毒素，3d后觀察到葉片上可產(chǎn)生類似于真菌感染后產(chǎn)生的病斑，病斑中心成黃褐色枯斑，周圍產(chǎn)生黃色暈圈，具明顯的同心輪紋。表明病菌粗毒素對葉片細胞組織具有致病危害作用。試驗結(jié)果為毒素在病程中是主要致病因子提供了佐證(圖6)。

圖5 病菌在不同振蕩條件下產(chǎn)生的粗毒素對豇豆種子萌發(fā)及胚芽生長抑制率的影響Fig.5 Effect of crude toxin under different shaking conditions on the inhibitory rate of cowpea seed germination and germ growth

圖6 針刺葉片接種毒素后的癥狀(24 h)Fig.6 Leaf symptoms after stab inoculation with the toxin(24 h)

幼苗浸漬致萎法測定表明，豇豆輪紋病病菌粗毒素可以對豇豆幼苗產(chǎn)生明顯的毒害作用。毒素處理24 h后，豇豆幼苗開始脫水呈現(xiàn)青枯狀，48 h后，用毒素處理的幼苗完全脫水萎蔫(圖7)。

圖7 毒素處理后萎蔫(2 d)Fig.7 Wilting after treatment with toxin(2 d)

不同寄主對粗毒素的敏感性測定結(jié)果表明(表2)，針刺接種3d后，10種供試植物中，豆科及茄科作物植株均產(chǎn)生不同程度的病斑，其中大豆、菜豆、茄子上的病斑較大，分別為2.0、1.2、1.5 cm；然而葫蘆科作物中的黃瓜及西葫蘆均未產(chǎn)生病斑，絲瓜病斑直徑為1.2 cm；番茄、辣椒、花生病斑相對較小。

表2不同寄主上毒素致病反應(yīng)測定1)

Table2Toxicitydeterminationofthecrudetoxinondifferenthostplants

寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions番茄Tomato0．5e花生Peanut0．3f辣椒Pepper0．2f大豆Soybean2．0a茄子Eggplant1．5b西葫蘆Squash0g 菜豆Bean1．0d黃瓜Cucumber0g 豇豆Cowpea1．2c絲瓜Suakwavegetablesponge1．2c

1) 不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。 Different small letters indicated significant difference at 0.05 level.

3 討論

植物病原菌毒素能使寄主產(chǎn)生特定癥狀反應(yīng)，在植物病害發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯致病或致毒作用，是一類重要的致病因子[5-6]。1975年Onesirosan等[7]最先報道了多主棒孢能產(chǎn)生毒性物質(zhì)。1983年，Toder[8]研究表明：病菌致病粗毒素在適當?shù)倪x擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體。然而培養(yǎng)基內(nèi)毒素的產(chǎn)生量直接受培養(yǎng)基成分和外界環(huán)境條件的影響[9-10]。因此為了篩選出抗病突變體，病原菌粗毒素培養(yǎng)條件的篩選是其基礎(chǔ)，但是在國內(nèi)尚無報道豇豆輪紋病粗毒素培養(yǎng)條件的篩選。本研究結(jié)果表明：豇豆輪紋病產(chǎn)毒最適培養(yǎng)液為查彼培養(yǎng)液，光照有利于病原菌粗毒素的產(chǎn)生。病原菌在0～35 ℃之間均可產(chǎn)生毒素，在25 ℃時毒素的產(chǎn)量最高。在pH 8的條件下粗毒素產(chǎn)生最多，振蕩可以促進病原菌粗毒素的產(chǎn)生。隨著時間的延長病原菌粗毒素產(chǎn)生量逐漸增加，在15 d時達到最大。病原菌毒素活性測定結(jié)果顯示，針刺接種的離體葉片在48 h后即可產(chǎn)生直徑為1cm的病斑，幼苗浸漬在毒素中48 h后萎蔫，由此可知病原菌粗毒素的致病性較高。在10種供試寄主植物中，病原菌粗毒

素可以侵染7種，其中大豆、茄子、菜豆等測試植株病斑最大達到1cm以上，從而證明其侵染寄主范圍之廣。因此，在生產(chǎn)實踐中，應(yīng)將豇豆與大豆、茄子、菜豆等敏感作物分離種植，避免作物之間的交叉感染，引起病害的蔓延，造成經(jīng)濟損失。

本研究證實了豇豆輪紋病病菌粗毒素的致病性,明確了豇豆輪紋病病菌的產(chǎn)毒條件及致病性,為毒素的純化和進一步深入研究其理化特性、活性組分、致病機理及利用毒素進行抗病品種篩選提供了理論基礎(chǔ)。

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OptimizationofculturingconditionsfortoxinproductionbyCorynesporacassiicola

Liu Zhiheng1, Li Jianbing1, An Xin1, Li Wei1, Cao Youwen2, Wang Junhe1

(1.PlantProtectionCollege,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2.PlantProtectionStationofZhangwuCounty,Fuxin123200,China)

Toxin production byCorynesporacassiicolawas investigated under different culture medium,culturing duration,temperature,pH,light or shaking conditions by determining the inhibitory rate of seed germination and germ growth.The results showed that toxin activity was different under different culture conditions.The optimal culture conditions were as follows: pH 7-8,20-25 ℃,culturing in Czapek’s liquid medium under light and shaking conditions for 15 h.Toxicity bioassay demonstrated that the crude toxin had high toxicity to soybeans and kidney beans with the larger lesion,while no toxicity to cucumber plants.

cowpea ring spot;Corynesporacassiicola; toxin; activity

2013-06-12

：2013-11-25

S 436.43

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.010

* 通信作者 E-mail: lzhh1954@163.com