大黃牡丹湯組方對急性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的影響

張延英，汪永鋒，張艷霞，李存祥，康萬榮

(甘肅中醫(yī)學院 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室 甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室，蘭州 730000)

急性胰腺炎(acute Pancreatitis，AP)是一種由胰酶激活引起的常見急腹癥之一，由于胰腺腺泡細胞內(nèi)酶原異常激活，導致胰腺局部炎癥反應，其發(fā)病急、病程快、并發(fā)癥多、病情危重、死亡率高，中醫(yī)將之歸屬于“結胸”“陽明腑實證”等范疇，用通里攻下治療[1]。經(jīng)中醫(yī)臨床應用證明，大黃牡丹湯組方(RPDP)具有清熱解毒，通里攻下，活血涼血，消痞除滿等功效，對AP有很好的療效。近年來，有研究對細胞凋亡在急性胰腺炎發(fā)病中所起的作用進行了探索，但RPDP對實驗性急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡的影響及其機制的研究較少。本研究將對一次口服給予RPDP后急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡情況及其機制進行觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級實驗動物和屏障實驗室均由甘肅中醫(yī)學院提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2011-0001，使用許可證號:SYXK(甘)2011-0001；SPF雄性SD大鼠60只，體質量200～260 g。將60只SD大鼠隨機分為藥物作用12 h假手術(SO)組、模型組和RPDP組，藥物作用24 h SO組、模型組和RPDP組，每組各10只。分別于RPDP治療后12 h和24 h后處死大鼠并取材。

1.2 藥物、主要試劑與儀器 RPDP由甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室制成生藥濃度為4 kg/L的藥液。牛磺膽酸鈉、TUNEL試劑盒、血清淀粉酶、一氧化氮(NO)和誘生型iNOS測定試劑盒均購自蘭州碩達生物技術公司。所需儀器設備由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供。

1.3 AP模型的建立、治療和取材 SPF級SD大鼠分為藥物作用12 h SO組、AP模型組和RPDP治療組，藥物作用24 h SO組、AP模型組和RPDP治療組。SO組大鼠在開腹后僅輕輕翻動胰腺和胰膽管然后關腹。大鼠禁食，自由飲水12 h后，3%戊巴比妥麻醉下，經(jīng)上腹部正中切口進入腹腔，提起胃、十二指腸，顯露出胰腺，確認膽胰管，在其近端和遠端均以動脈夾暫時結扎，將帶有四號針頭的1 mL注射器沿十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開口0.3 mm處的膽管，注入3.5%的?；悄懰徕c0.1 mL/100 g，以0.1 mL/min的速度注射完成，停留5 min，去除結扎線，指壓穿刺點，查無漏膽，逐層關腹。對照組僅牽引胰腺和十二指腸后關腹[2]。術后10～15 min清醒后限制飲水，籠中自由活動。建立大鼠AP模型，造模后2 h灌胃，治療組給予RPDP劑量為40 g/kg(10 mL/kg)灌胃1次，相當于成人劑量的20倍，模型組和SO組用等量的生理鹽水灌胃1次。給藥后12 h和24 h兩個時間段麻醉股動脈取血,每只動物分兩個采血管，肝素抗凝管分離血漿，普通管分離血清；取血后開腹取胰腺組織，胰體迅速制備勻漿，檢測胰腺組織中NO含量和iNOS的活性;胰頭組織完全浸入4%多聚甲醛,每日更換1次4%多聚甲醛，3 d后用石蠟包埋，用原位缺口末端標記法檢測胰腺組織細胞凋亡率。

1.4 血清淀粉酶，胰腺組織N0含量、iNOS活性和腺泡細胞凋亡測定 用普通采血管分離血清，檢測血清淀粉酶；檢測胰腺組織勻漿中NO含量和iNOS活性，按照NO含量和iNOS活性試劑盒提供的方法進行檢測,用TUNEL凋亡細胞試劑盒說明書進行定量檢測胰腺腺泡細胞的凋亡。用盲法計數(shù)，選取每張TUNEL陽性切片陽性細胞數(shù)最多的高倍視野8個，每個高倍視野計數(shù)100個細胞和其中的凋亡細胞，凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/800×100%。

2 結果

2.1 手術后觀察 取血后開腹觀察胰腺，模型組和治療組有腹水，胰腺局部腫脹變硬，模型組的壞死灶比治療組多；SO組腹腔內(nèi)未見腹水和其他異常，胰腺正常。

2.2 血清淀粉酶活性 AP模型組血清淀粉酶顯著高于SO組；與AP模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h血清淀粉酶顯著降低(P<0.05)；與12 hRPDP治療組比較，24 hRPDP治療組血清淀粉酶顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.3 胰腺組織NO含量和iNOS活性 AP模型大鼠胰腺組織NO含量和iNOS活性顯著低于SO組；與AP模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h，胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05)；與12 h RPDP治療組比較，24 h RPDP治療組NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.4 細胞凋亡指數(shù) 實驗結果顯示，SO組和模型組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡發(fā)生率較低；與模型組比較，RPDP治療后12 h和24 h胰腺腺泡細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與12 h RPDP治療組比較，24 h RPDP治療組胰腺腺泡細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 RPDP對SD大鼠血清中淀粉酶、NO、iNOS和細胞凋亡的影響

注：與SO組比，#P<0.05；與12 h比，△P<0.05

3 討論

AP較輕時胰腺腺泡細胞凋亡較多，很少有壞死，AP較重時胰腺腺泡細胞壞死較多，很少有細胞凋亡；胰腺腺泡細胞凋亡之后，多種酶原物質從腺泡細胞內(nèi)釋放到腺泡細胞外，致胰腺炎癥反應減輕[3-4]。細胞凋亡有可能是機體自我保護的一種現(xiàn)象，胰腺腺泡細胞凋亡，有可能減輕AP的嚴重程度。Flint RS研究說明，病情嚴重程度與胰腺腺泡細胞凋亡呈負相關[5]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺組織損害越嚴重，胰腺細胞凋亡指數(shù)就越低，RPDP對胰腺細胞凋亡有誘導作用。

胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性在AP中有何作用，AP時胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性顯著降低，Werner J認為iNOS活性誘導胰腺腺泡細胞使其NO含量增加，一定含量的NO對AP胰腺微循環(huán)有所改善，NO能保護血管內(nèi)皮細胞，從而對胰腺腺泡細胞起到了保護作用，AP的嚴重程度減輕了[6],內(nèi)源性的NO阻斷或含量減少有可能加重AP損傷[7-8]。實驗說明，經(jīng)RPDP治療后胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性增加，血清淀粉酶降低和誘導胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)增加，此實驗結果與Thatte U研究一致[9]。RPDP對AP胰腺組織有保護作用是通過增加胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性，協(xié)同誘導胰腺腺泡細胞凋亡而實現(xiàn)，但其作用機理還需要大量研究來進一步闡明。

[1]高青松,劉源,張濤,等.不同類型脂肪酸對SD大鼠血清生化指標及胰島素抵抗的影響[J].實驗動物科學,2010,27(1):16-21.

[2]張馨木,孫波,李志滿,等.重組人KD/APP var對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎作用的研究[J].實驗動物科學,2010,27(5):26-28.

[3]Kaiser A M,Saluja A K,Sengupta A,et al.Relationship between severity,necrosis,and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis[J].The American Journal of Physiology,1995,269(5 Pt 1):C1295-C1304.

[4]Saluja A,Hofbauer B,Yamaguchi Y,et al.Induction of apoptosis reduces the severity of caerulein-induced pancreatitis in mice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1996,220(3):875-878.

[5]Flint R S,Phillips A R,Power S E,et al.Acute pancreatitis severity is exacerbated by intestinal ischemia-reperfusion conditioned mesenteric lymph[J].Surgery,2008,143(3):404-413.

[6]Werner J,Fernndez-del Castillo C,Rivera J A,et al.On the protective mechanisms of nitric oxide in acute pancreatitis[J].Gut,1998,43(3):401-407.

[7]張在興,孫家邦,李非,等.內(nèi)源性一氧化氮對大鼠急性壞死性胰腺炎的胰腺保護作用[J].中華普通外科雜志,2000,15(10):29-31.

[8]吳濤,陳熹,紀宗正.精氨酸對急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007,28(17):1570-1572.

[9]Thatte U,Bagadey S,Dahanukar S.Modulation of programmed cell death by medicinal plants[J].Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-Grand,France),2000,46(1):199-214.